四環(huán)素對孤雌產(chǎn)雌松毛蟲赤眼蜂生殖表型及適合度的影響

霍梁霄，周金成，張 琛，趙 倩，董 輝

(沈陽農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，沈陽 110161)

Wolbachia是一類廣泛分布于節(jié)肢動物類群和線蟲中、隨母系遺傳的專性胞內(nèi)共生菌(Werrenetal.，2008)。Wolbachia能夠調(diào)控宿主生殖表型改變，主要包括：細胞質(zhì)不親和(Cytoplasmic Incompatibility，CI)、雌性化(Feminization)、殺雄(Male Killing，MK)和誘導孤雌產(chǎn)雌生殖(Parthenogenesis Induction，PI)(Werren，1997；施婉君等，2002)。另一方面，Wolbachia還影響雄性黑腹果蠅Drosophilamelanogaster的侵略性(Rohrscheibetal.，2015)和活躍狀態(tài)(Vale and Jardine，2015)、提高宿主的免疫力(Hedgesetal.，2008)、參與到縮基反顎繭蜂Asobaratabida的卵子發(fā)生過程(Dedeineetal.，2005)和提高松毛蟲赤眼蜂Trichogrammadendrolimi的功能反應(Dongetal.，2017)。通過利用Wolbachia對宿主的這些調(diào)控作用，可以實現(xiàn)對宿主生物的改造，從而達到控制有害生物或提高天敵防治潛力的作用(Werrenetal.，2008；Brucker and Bordenstein，2012；Le Page and Bordenstein，2013)。因此，Wolbachia與宿主之間的互作一直是近年來研究的熱點。

由于胞內(nèi)共生菌Wolbachia無法在宿主細胞外生存，這種特性增加了研究共生菌Wolbachia的困難(Werrenetal.，2008)。一般而言，通過抗生素處理能夠獲得Wolbachia去除或滴度降低的宿主種群，可用以研究Wolbachia對宿主的調(diào)控作用。目前，最常用的抗生素是四環(huán)素，其次是利福平(Lietal.，2014)。Dobsonetal.(2002)借助四環(huán)素探究了Wolbachia對宿主白紋伊蚊Aedesalbopictus的影響。Wangetal.(2017)通過四環(huán)素處理麗蚜小蜂EncarsiaFormosa，證明Wolbachia密度可以影響宿主的性別決定。Almeidaetal.(2010)利用利福平去除一種赤眼蜂T.atopovirilia體內(nèi)的Wolbachia，用以研究Wolbachia對宿主行為的影響。高溫、密集飼養(yǎng)和營養(yǎng)脅迫處理也能夠降低Wolbachia滴度(Wiwatanaratanabutr and Kittayapong，2009；Zhuetal.，2012；Rossetal.，2016)，但這些方法均不如抗生素處理普遍。研究者們大多只關注抗生素處理后對Wolbachia介導下宿主相關表型的影響，然而抗生素處理也可能對宿主的適合度產(chǎn)生影響。抗生素處理下宿主適合度的變化以及宿主體內(nèi)Wolbachia滴度的變化均有可能影響宿主表型。為排除抗生素對宿主的“附加效應”，抗生素處理感染宿主時應當考慮對宿主適合度的潛在影響。

赤眼蜂是一種廣泛應用于生物防治的鱗翅目害蟲卵期寄生蜂，其性別決定方式為單雙倍體決定型，即二倍體受精卵可發(fā)育為雌蜂，未受精的單倍體卵可發(fā)育為雄蜂(潘雪紅等，2007)。然而，Wolbachia可誘導赤眼蜂發(fā)生孤雌產(chǎn)雌生殖現(xiàn)象(Stouthameretal.，1993；Arakakietal.，2000；Russell and Stouthamer，2011；Reumeretal.，2012)，即未受精的卵恢復二倍體發(fā)育成雌蜂。前人研究發(fā)現(xiàn)抗生素處理可以恢復感染赤眼蜂的兩性生殖(Stouthameretal.，1990)，但是抗生素對赤眼蜂適合度的影響尚不清楚。本研究采用不同濃度的四環(huán)素連續(xù)飼喂產(chǎn)雌孤雌生殖的松毛蟲赤眼蜂5個世代，觀察統(tǒng)計各世代下不同濃度四環(huán)素處理后松毛蟲赤眼蜂的繁殖力(黑卵數(shù))、羽化率(羽化出蜂的數(shù)量占黑卵數(shù)的比值)及子代雄蜂比(子代雄蜂占子代數(shù)量的比值)，探究四環(huán)素處理對松毛蟲赤眼蜂適合度的影響，為研究Wolbachia與寄主之間相互作用的機制提供一種技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料

產(chǎn)雌孤雌生殖的松毛蟲赤眼蜂及其寄主米蛾Corcyracephalonica均來自于沈陽農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲生物防治實驗室。孤雌產(chǎn)雌生殖的松毛蟲赤眼蜂由人工轉染W(wǎng)olbachia獲得，并用新鮮米蛾卵在室內(nèi)(25±1℃，RH 75%±5%，16 L ∶8 D)連續(xù)飼養(yǎng)多代。

寄主米蛾在養(yǎng)蟲室內(nèi)(25±1℃，RH 75%±5%，16 L ∶8 D)用面粉繁育多代。試驗前取新鮮的米蛾卵(<24 h)粘在涂有阿拉伯樹膠的白色紙卡上，制成米蛾卵卡。米蛾卵卡用紫外燈照射處理40 min，以便殺死胚胎防止米蛾卵孵化吃掉被寄生的卵，影響實驗結果。處理后的米蛾卵卡供松毛蟲赤眼蜂寄生。試驗所用的四環(huán)素購于大連寶生物公司，所用蜂蜜為荊條蜂蜜，購自沈陽農(nóng)業(yè)大學沈農(nóng)寶蜂蜜有限公司。

1.2 方法

將50 mg、150 mg、250 mg四環(huán)素分別溶于10 mL 50%蜂蜜水，配制成四環(huán)素濃度分別為5 mg/mL、15 mg/mL、25 mg/mL抗生素-蜂蜜水溶液,存于4℃冰箱中備用。

隨機選取羽化時間一致(<24 h)的赤眼蜂作為供試蜂，供試蜂分為4組，每組設20個重復，其中1組為對照組，喂食不含四環(huán)素的50%蜂蜜水；其余3組分別喂食含有濃度為5 mg/mL、15 mg/mL、25 mg/mL四環(huán)素的蜂蜜水。為保證供試蜂能夠充分接觸并取食蜂蜜水，預先用與指型管等長的棉線蘸取蜂蜜水后移入指型管(直徑1.0 cm，長度4.5 cm)，保證棉線沿管口至管底延伸，使隨后接入的供試蜂能夠充分接觸并取食棉線上的蜂蜜水。供試蜂引入至指型管喂食蜂蜜水12 h后，把米蛾卵卡(卡上約100粒卵)放入指型管內(nèi)，供其寄生。為防止羽化出的子代雄蜂與子代雌蜂交配，被寄生的米蛾卵從最初的淡黃色變成黑色(赤眼蜂正在蛹期)，將單粒黑卵剪下置于指形管中，剩下的黑卵置于原指形管中。赤眼蜂羽化后(F1代)，對單粒黑卵羽化的雌蜂重復上述操作至F5代。統(tǒng)計各世代下赤眼蜂的繁殖力(黑卵數(shù))。根據(jù)觸角形態(tài)和外生殖器鑒定子代性別，在雙目顯微鏡下觀察并記錄各世代下子代性別及子代個數(shù)。統(tǒng)計各世代松毛蟲赤眼蜂羽化數(shù)、羽化率(羽化出蜂的數(shù)量占黑卵數(shù)的比值)、雄蜂數(shù)、雄蜂率(子代雄蜂占子代數(shù)量的比值)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗結果采用雙因素方差分析，檢驗了不同世代下的四環(huán)素不同濃度處理對松毛蟲赤眼蜂繁殖力、羽化率以及雄性比的影響。采用Breusch-Pagan檢驗對數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差一致性假定進行檢驗。各世代下不同四環(huán)素處理下各試驗指標間的多重比較采用Duncan’s新復極差檢驗。所有數(shù)據(jù)結果采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 四環(huán)素和處理世代對繁殖力的影響

與對照組相比，各世代中不同濃度四環(huán)素處理的雌蜂繁殖力均顯著降低(P< 0.05)(圖1)。不同世代的對照組雌蜂繁殖力無顯著差異，在60～70粒之間。四環(huán)素不同濃度和處理世代對雌蜂繁殖力具有交互作用影響。在F1代、F2代和F5代中，雌蜂繁殖力隨四環(huán)素濃度的增加而下降，但在F3代和F4代中，抗生素濃度對雌蜂繁殖力無顯著差異(P> 0.05)。各世代下雌蜂繁殖力在F2代達到最高，但在F3代達到最低。

圖1 四環(huán)素濃度和處理世代對繁殖力的影響Fig.1 The fecundity as influenced by tetracycline concentrations and treatment generations注：圖中誤差柄為平均值±標準誤。不同字母表示各世代下不同濃度四環(huán)素處理下的繁殖力在0.05水平上差異顯著性。Note: The errorbars represent the Mean±SE. Different letters represent the significant difference of fecundity in each concentration in the same generation at 0.05 level.

2.2 四環(huán)素和處理世代對子代羽化率的影響

與對照組相比，各世代中不同濃度四環(huán)素處理對子代羽化率的影響不具有一致性(圖2)，F(xiàn)2和F4代四環(huán)素處理的子代羽化率顯著低于相應對照組(P< 0.05)，但F1、F3和F5代四環(huán)素處理的子代羽化率與對照組相比無顯著差異(P>0.05)。各世代相應對照組的子代羽化率基本一致，其子代羽化率在80%到90%之間。在F2代中，5 mg/mL的四環(huán)素處理后，子代羽化率最低，為64.87%±1.14%。在F4代中，15 mg/mL和25 mg/mL的四環(huán)素處理后，子代羽化率最低，分別為60.03%±2.33%和58.43%±2.33%。

圖2 四環(huán)素濃度和處理世代對子代羽化率的影響Fig.2 The emergence rate of offsprings as influenced by tetracycline concentrations and treatment generations注：圖中誤差柄為平均值±標準誤。不同字母表示各世代下不同濃度四環(huán)素處理下的羽化率在0.05水平上差異顯著性。Note: The errorbars represent the Mean±SE. Different letters represent the significant difference of emergence rate in each concentration in the same generation at 0.05 level.

2.3 四環(huán)素和處理世代對子代雄性比的影響

不同濃度四環(huán)素連續(xù)處理松毛蟲赤眼蜂5代后，各世代下均出現(xiàn)了雄性后代(圖3)。在F1代中，15 mg/mL的四環(huán)素處理的子代雄性比達到最高，為6.07%±1.87%，其余濃度處理組子代雄性比與對照組之間無顯著差異(P>0.05)。相同濃度的四環(huán)素處理下，F(xiàn)2代子代雄性比顯著高于F1代(P< 0.05)。F2代中，各濃度處理組的子代雄性比之間無顯著差異(P>0.05)。相同四環(huán)素處理濃度下，F(xiàn)3代子代雄性較F2進一步顯著上升(P< 0.05).在F3代中，5 mg/mL和15 mg/mL四環(huán)素處理的子代雄性比較高，分別為33.28%±7.08%和33.03%±6.64%。F4代中，5 mg/mL和15 mg/mL四環(huán)素處理的子代雄性比與F3代相比無顯著差異(P>0.05)，但25 mg/mL四環(huán)素處理的子代雄性比達到最高，為87.02%±5.40%。F5代中，5 mg/mL和15 mg/mL四環(huán)素處理的子代雄性比與F3和F4代相比又進一步上升(P< 0.05),但25 mg/mL四環(huán)素處理的子代雄性比與F4代相比顯著下降(P< 0.05)。

圖3 四環(huán)素濃度和處理世代對子代雄性比的影響Fig.3 The male ratio of offsprings as influenced by tetracycline concentrations and treatment generations注：圖中誤差柄為平均值±標準誤。不同字母表示各世代下不同濃度四環(huán)素處理下的雄性比在0.05水平上差異顯著性。Note: The errorbars represent Mean±SE. Different letters represent the significant difference of male ratio in each concentration in the same generation at 0.05 level.

3 結論與討論

從恢復松毛蟲赤眼蜂兩性生殖表型的角度上，不同濃度四環(huán)素處理松毛蟲赤眼蜂1個世代并不能達到預期效果。較低濃度的四環(huán)素對松毛蟲赤眼蜂兩性生殖表型的恢復效果(子代雄性比)隨處理世代增加而提升。然而，高濃度四環(huán)素處理下，松毛蟲赤眼蜂兩性生殖表型的恢復效果在前4個世代中隨處理世代的增加而上升，但在第5個世代中子代雄性比回落?？傮w而言，各濃度四環(huán)素連續(xù)處理2個世代后才會對松毛蟲赤眼蜂兩性生殖表型有顯著的恢復作用。在恢復松毛蟲赤眼蜂兩性生殖表型的條件下，還需進一步選擇對松毛蟲赤眼蜂適合度影響最小的四環(huán)素處理方式。

本文通過研究繁殖力和羽化率來檢驗抗生素對松毛蟲赤眼蜂的“附加效應”。在松毛蟲赤眼蜂恢復兩性生殖表型的基礎上，從繁殖力角度上看，四環(huán)素連續(xù)處理赤眼蜂2個世代對雌蜂繁殖力影響最小。四環(huán)素對雌蜂繁殖力的影響隨世代的增加具有累加效應(圖1)。從松毛蟲赤眼蜂子代的致死作用(羽化率)的結果得知，四環(huán)素連續(xù)處理雌蜂3個世代對松毛蟲赤眼蜂羽化率影響最小(圖2)。因此，綜合抗生素對羽化率和繁殖力的影響，應當選用較低的抗生素濃度處理松毛蟲赤眼蜂2個世代或3個世代。

業(yè)已證明，抗生素可以用于降低宿主體內(nèi)的Wolbachia滴度，進而削弱Wolbachia對宿主生殖表型的調(diào)控能力。因此，通過抗生素處理的宿主能夠用于確定Wolbachia調(diào)控宿主相關表型表達的一種技術手段。Maetal.(2015)研究發(fā)現(xiàn)一種產(chǎn)雌孤雌的寄生蜂A.japonica的子代雄蜂比例隨著Wolbachia滴度的降低而增加。有研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)雌孤雌生殖的麗蚜小蜂子代雄性比例也隨著Wolbachia滴度降低而增加(Stouthamer and Mak，2002)。在赤眼蜂中，這類現(xiàn)象也已被證明。陳茜等(2016)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)雌孤雌生殖的食胚赤眼蜂T.embryophagum雄蜂比例隨著Wolbachia滴度的降低而增加。許多這類研究均指出，Wolbachia滴度與控制宿主生殖表型的表達之間存在正相關關系(Breeuwer and Werren，1993；Bourtzisetal.，1996；Zchori-Feinetal.，2000；Ikedaetal.，2003；Pascaletal.，2004)。Stouthamer(1997)認為通過抗生素等手段降低宿主體內(nèi)的Wolbachia滴度，可以削弱Wolbachia對宿主卵細胞第一次有絲分裂的干擾作用，使胚胎配子復制失敗，進而使宿主仍然維持胚胎染色體的單倍狀態(tài)，最終發(fā)育為雄性個體。

從結果中發(fā)現(xiàn)四環(huán)素處理孤雌產(chǎn)雌生殖的的松毛蟲赤眼蜂后，雌蜂繁殖力低于對照組，各世代下雌蜂繁殖力隨四環(huán)素濃度的增加而下降。四環(huán)素能夠影響松毛蟲赤眼蜂的寄生功能，導致雌蜂寄生能力降低。造成這種結果的原因可能由于以下三個方面：(1)四環(huán)素處理感染宿主可以引起Wolbachia滴度的變化，導致感染宿主的適合度發(fā)生改變?；驔_突假說認為，在宿主胚胎中，Wolabchia和宿主基因存在博弈關系。單倍體宿主的核基因仍然趨向于使宿主發(fā)育為雄性子代，而Wolbachia趨向于使宿主第一次有絲分裂失敗，促使胚胎染色體加倍。雙方的這種競爭關系將造成宿主產(chǎn)生一定的適合度代價，而較低的Wolbachia滴度將使這種“拉鋸戰(zhàn)”的時間延長，進而對宿主適合度造成負面影響，甚至使宿主胚胎“敗育”。有研究表明，在這種博弈關系下，孤雌產(chǎn)雌生殖的赤眼蜂胚胎的流產(chǎn)率顯著高于兩性生殖的赤眼蜂胚胎(Tagamietal.，2001)。相關研究發(fā)現(xiàn)，Wolbachia感染下的蜆蝶赤眼蜂T.kaykai的繁殖率和羽化率均顯著降低(Hohmannetal.，2001；Miura and Tagami，2004)。Liuetal.(2018)發(fā)現(xiàn)Wolbachia對松毛蟲赤眼蜂的適合度存在負面影響。(2)四環(huán)素的作用機制為阻斷原核生物30S核糖體亞基，進而抑制轉錄及蛋白合成。因此，四環(huán)素可能對宿主線粒體的蛋白質(zhì)合成產(chǎn)生抑制作用(Zhangetal.，2005)。前人研究發(fā)現(xiàn)四環(huán)素會降低擬果蠅D.simulans體內(nèi)線粒體的功能，減少宿主ATP產(chǎn)物的合成，從而影響擬果蠅的生殖力和壽命(Ballard and Melvin，2007)。(3)抗生素在清除Wolbachia靶標微生物的同時，可能也對宿主體內(nèi)的其他共生微生物產(chǎn)生負面影響，導致宿主體內(nèi)菌群失衡。一些共生菌也可能與宿主共用代謝通路，參與宿主維生素及其他營養(yǎng)成分的合成(Lvetal.，2018)。因此，抗生素處理感染宿主時，應充分考慮抗生素處理的非靶標作用。

根據(jù)研究結果推測，在特定抗生素濃度處理下，隨抗生素處理宿主代數(shù)的增加，抗生素也可能對宿主產(chǎn)生毒物興奮作用(Daviesetal.，2006；Linaresetal.，2006；Miglioreetal.，2013)。宿主可能在前期對抗生素的適應性較差，但隨處理世代的增加，宿主赤眼蜂體內(nèi)解毒功能逐步激活，適合度有所恢復。然而，宿主對適合度的恢復能力可能不具有持續(xù)性，若繼續(xù)增加處理世代數(shù)，其適合度變化將再次出現(xiàn)反復。根據(jù)赤眼蜂羽化率的變化情況，推測四環(huán)素處理感染W(wǎng)olbachia的赤眼蜂后，各世代下的雌蜂對不同四環(huán)素濃度的耐受能力不同，雌蜂在低濃度的抗生素條件下能夠進行自我修復一部分損傷，而高濃度抗生素處理對宿主造成的損傷具有不可逆性。

通過抗生素處理宿主來研究共生菌對宿主相應功能表型的影響是一種模式方法。但在進行這類研究中，應當考慮排除或降低抗生素對宿主生殖表型影響之外的非靶標作用影響。本研究將對這類研究方法的嚴謹性和科學性提供新的工作思路和數(shù)據(jù)支持。在抗生素使用量能夠恢復松毛蟲赤眼蜂兩性生殖表型的基礎上，本試驗結果能夠為四環(huán)素去除Wolbachia提供推薦使用量和使用方法，從而使抗生素對宿主赤眼蜂的“附加效應”影響最小。關于抗生素的使用量還有待于明確，有關這類研究應當更加全面和深入的開展。