甲基硬脂酸酯和E-β-羅勒烯對中華蜜蜂育王質量的影響

胡景華，趙方媛，張麗珍，江武軍，廖春華，顏偉玉*

(1. 江西農業大學蜜蜂研究所，南昌 330045；2. 江西省養蜂研究所，南昌 330052)

中華蜜蜂Apisceranacerana(簡稱中蜂)擅于采集零星蜜源且抗胡蜂及抗蜂螨能力較強，是我國特有的當家蜂種，對我國養蜂業的發展以及生態系統的平衡均有著重要的作用(王靜等，2013)。但由于西方蜜蜂的大量引入，中蜂存在競爭劣勢使得生存資源驟減，種群的數量和分布區域均逐年下降(余林生，2007)。蜂王作為蜂群中唯一雌性生殖器官發育完全者，其專職任務就是產卵，因此蜂王品質優劣對蜂群的群勢和生產性能等至關重要。優質的蜂王不僅有利于蜂群維持強群，且在產卵性能、抗逆性以及經濟效益等方面均有重要意義(匡邦郁，2003)。因此，培育優質的蜂王可以顯著提高蜂群的生產效益和競爭優勢。

早期研究中單式移蟲育王的發明實現了人工科學育王，后期的復式移蟲則更進一步的提高了王臺接受率和蜂王質量(Doolittle，1888；陳世壁，1989)。Le Conte研究發現，在培育西方蜜蜂蜂王過程中添加幼蟲信息素成分甲基硬脂酸酯(MS)可提高王臺接受率，添加甲基亞油酸酯(ML)可促進工蜂吐漿進而增加王臺內王漿量，而甲基棕櫚酸酯(MP)的使用則可提高王臺中幼蟲重量(Le Conteetal.，1995)。曾云峰等在蜂王培育過程中添加信息素，發現0.1% MP提高了中意蜂蜂王幼蟲的重量(曾云峰等，2010)。鄒垂彬等在中蜂育王過程中添加MP和ML，研究結果表明MP和ML并不能提高中蜂蜂王質量(鄒垂彬等，2016)。

Gilley等在成年蜂王頭部發現E-β-羅勒烯，未能成功介紹到無王群的蜂王E-β-羅勒烯含量在一周內一直處于相當低的水平(Gilleyetal.，2006)。另外在西方蜜蜂蜂群中添加E-β-羅勒烯可以顯著提高蜂群對蜂王的接受率(Degrandi-Hoffmanetal.，2007)。在正常蜂群中由于存在蜂王信息素和幼蟲信息素，可以抑制工蜂卵巢發育，從而防止工蜂產卵。Maisonnase等研究發現幼蟲體表存在一種高揮發性物質E-β-羅勒烯，可以有效抑制工蜂卵巢的發育(Maisonnasseetal.，2009)。E-β-羅勒烯作為一種高揮發性信息素，很容易在整個蜂群中擴散，對各階段工蜂的生理及行為均會產生影響。Maisonnasse等研究表明提高蜂群中E-β-羅勒烯濃度工蜂的采集日齡會提早，以增加食物儲存量，為蜂群和幼蟲提供更優質和充足的營養(Maisonnasseetal.，2010)。此外，E-β-羅勒烯還可以促進工蜂王漿腺的發育，從而影響蜂王漿的分泌(Traynoretal.，2014)，因此幼蟲信息素E-β-羅勒烯與幼蟲食物息息相關。后期大量研究證實，E-β-羅勒烯是蜜蜂幼蟲的饑餓信息素，它與蜂群中食物信息相關，可以在調控哺育蜂發育的同時調控整個蜂群的采集行為(Maisonnasseetal.，2010；Traynoretal.，2014)。

為了進一步研究幼蟲信息素成分甲基硬脂酸酯和E-β-羅勒烯對中蜂育王的影響，本研究通過在育王過程中添加甲基硬脂酸酯和E-β-羅勒烯，研究其對蜂王初生重、胸重、胸寬、單側卵巢管數量以及Vg、hex70b和hex1103個基因表達量的影響，為培育優質中蜂蜂王提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗蜂群

試驗所需蜂群為中蜂，均由江西農業大學蜜蜂研究所飼養。試驗選取蜂群群勢(5足框)、蜂群遺傳性狀和蜂王年齡都基本相似的3群蜂作為哺育蜂群。另取1群蜂王產卵性能良好的健康蜂群作為母本群用于產卵。育王在哺育群中進行，每群至少育王3次。試驗期間，對蜂群進行獎勵飼喂，提高工蜂哺育積極性。

1.2 免移蟲育王

利用中華蜜蜂免移蟲育王生產器(江西農業大學蜜蜂研究所研制)培育蜂王，免移蟲育王的具體操作參照鄒垂彬等(2016)的試驗方法進行。同時，在幼蟲60～64 h時，往王臺中注入1 μL不同濃度(濃度梯度分別為0%、0.1%、1.0%、10.0%)的幼蟲信息素酯類成分(Sigma試劑公司，純度≥99%)與臺內王漿液混合，每個濃度梯度設3個生物學重復，3個技術重復。在蜂王出房前1 d取出育王框，并將單個王臺小心取下置于自制王籠中，并一同放置于恒溫恒濕培養箱(BINDER)中進行孵化(35℃，RH 70%)，每隔1 h觀察蜂王出房情況。

1.3 蜂王外部指標測定

培養箱中蜂王出房后立刻用電子天平測定蜂王初生重以及胸重；同時，采用CCD觀察測試系統(江南永新光學有限公司)測量蜂王胸寬。測定胸重、胸寬的具體試驗方法參照胡景華等(2018)的試驗方法進行測定，記錄數據。

1.4 蜂王卵巢管計數

解剖蜂王卵巢管時為了便于卵巢管的剝離，蜂王出房后饑餓預處理(饑餓2～4 h)，消耗掉體內脂肪。然后，參考許少玉等(1984)的試驗方法對蜂王卵巢管進行解剖計數。

1.5 熒光定量PCR引物的設計及熒光定量PCR

蜂王出房后在超凈臺中解剖出蜂王卵巢，并參考秦秋紅的試驗方法對卵巢進行RNA提取以及反轉錄合成cDNA(秦秋紅，2013)。熒光定量PCR試驗中，Vg、hex110、hex70b基因以及內參基因(β-actin)的引物序列均沿用本人前期試驗中設計的引物序列(胡景華等，2018)(上海生工合成，表1)。熒光定量PCR反應體系(10 μL)：1 μL樣品cDNA，3.0 μL Nuclease-Free Water，上游引物和下游引物各0.4 μL，5 μL SYBR GREENⅡ以及0.2 μL ROX校正液。反應條件為95℃預變性30 s；95℃，10 s，58.9℃，1 min(40個PCR循環)；擴增反應結束后從55℃勻速加熱(每6 s升高1℃)至95℃，建立熔解曲線。每個樣品均設置3個重復。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences used in real time quantitative PCR

1.6 數據統計與分析

Vg、hex110和hex70b基因的表達量參考Livak等建立的2-ΔΔCt模型進行計算(Livak，2001)。利用StatView軟件對試驗數據進行統計分析，計算蜂王個體外部指標以及卵巢管數的均值和標準差。

2 結果與分析

2.1 甲基硬脂酸酯對中蜂蜂王質量的影響

2.1.1甲基硬脂酸酯對蜂王個體指標的影響

在育王過程中添加不同濃度的甲基硬脂酸酯進行處理，結果表明，0.1%、1.0%和10%濃度的試驗組蜂王初生重和胸部指標均無顯著差異(P>0.05)；但1.0%和10.0%的試驗組，蜂王卵巢管數明顯下降(P< 0.05)(表2)。

表2 甲基硬脂酸對蜂王個體指標的影響Table 2 Effects of MS on the index of queens

2.1.2甲基硬脂酸酯對蜂王卵巢Vg，hex70b和hex110表達量的影響

在育王過程中添加不同濃度的甲基硬脂酸酯對蜂王卵巢Vg、hex70b和hex110基因表達均無顯著影響(P>0.05)(圖1)。

圖1 MS對蜂王卵巢Vg (A)、hex70b (B)和hex110 (C)表達量的影響Fig.1 Effect of MS on the expression level of Vg (A), hex70b (B) and hex110 (C) in queen’s ovary注：圖中數據為平均數±標準差；柱上不同小寫字母表示差異顯著(t檢驗，P<0.05)。下同。Note: Data are mean±SD, and different lowercases above bars indicate significant difference (t-test, P<0.05). The same below.

2.2 E-β-羅勒烯對中蜂蜂王質量的影響

2.2.1E-β-羅勒烯對蜂王個體指標的影響

在育王過程中添加E-β-羅勒烯的結果表明，3個濃度處理組對中蜂蜂王的胸部指標均無顯著差異(P>0.05)；但添加10%濃度的E-β-羅勒烯，蜂王初生重顯著增加(P<0.05)；同時，1%和10%濃度E-β-羅勒烯處理可以顯著增加蜂王單側卵巢管數(P<0.05)(表3)。

表3 E-β-羅勒烯對蜂王個體指標的影響Table 3 Effects of E-beta-ocimene on the index of queens

2.2.2E-β-羅勒烯對蜂王卵巢Vg、hex70b和hex110表達量的影響

10.0%濃度的E-β-羅勒烯處理組，蜂王卵巢的Vg、hex70b和hex110基因表達量均顯著增加(P<0.05)；在1.0%濃度處理組，只有Vg和hex110兩個基因的表達量顯著增加(P<0.05)；而0.1%濃度處理組，Vg、hex70b和hex110基因表達量與對照組比較均無顯著差異(P>0.05)(圖2)。

圖2 E-β-羅勒烯對蜂王卵巢Vg (A)、hex70b (B)和hex110 (C)表達量的影響Fig.2 Effect of E-beta-ocimene on the expression level of Vg (A), hex70b (B) and hex110 (C) in queen’s ovary

3 討論與結論

卵黃原蛋白基因(Vg)的高表達可以促進蜂王卵巢的發育，并延長蜂王壽命(Engels，1974；Amdametal.，2005；張衛星等，2014)。蜂王體內Vg表達量與保幼激素(JHIII)以及昆蟲儲存蛋白基因(hexamerin，hex)的表達相關(Coronaetal.，2007；Martinsetal.，2010)。JHIII又與蜜蜂的發育以及極型分化相關，而hex為昆蟲從幼蟲到蛹的變態發育提供物質基礎和保障(Burmester & Scheller，1999；Barchuketal.，2007)。研究發現蜂王幼蟲體內JHIII的含量與hex70b和hex110的表達量呈正相關(龐倩等，2017a；龐倩等，2017b)，而hex70b以及hex110的表達水平與昆蟲的性別決定、壽命、免疫力以及繁殖力等生物學功能相關(Bitondi，2006；Martinsetal.，2008；Cristinoetal.，2010)。由此可推測Vg、hex70b和hex110基因的表達與蜂王體內JHIII水平相關并參與調控蜂王的卵巢發育，與蜂王的質量相關。

蜂王幼蟲的良好發育離不開工蜂的積極哺育。早期研究發現甲基硬脂酸酯作為幼蟲信息素之一，參與調節工蜂對幼蟲的哺育行為，西方蜜蜂育王過程中添加甲基硬脂酸酯會促進工蜂積極哺育，提高蠟質王臺接受率(Le Conteetal.，1995)。那么在中蜂育王過程中添加甲基硬脂酸酯是否也能促進工蜂積極哺育，使蜂王幼蟲發育過程中得到更多的營養物質，從而提高中蜂蜂王的質量？本研究利用中華蜜蜂免移蟲育王生產器，在育王過程中添加不同濃度的甲基硬脂酸酯，發現蜂王初生重、胸重和胸寬等個體指標均無顯著差異，1%和10%濃度處理組的單側卵巢管數顯著減少，Vg、hex70b和hex110基因表達量也無顯著差異。由此可見，甲基硬脂酸酯并未能顯著提高中蜂蜂王質量，這或許是由于中蜂對甲基硬脂酸酯的反應與意蜂有所差異，相關機理還有待于進一步深入研究。

已有研究表明E-β-羅勒烯作為饑餓信息素的一種成分可以促進工蜂吐漿(何旭江等，2016)，而蜂王漿是蜂王及3日齡以內幼蟲的主要食物，因此蜂群中E-β-羅勒烯濃度與蜂群食物或營養是否充足有關。本研究結果表明，中蜂育王過程中添加10%濃度E-β-羅勒烯可以顯著增加了蜂王初生重和單側卵巢管數，而且Vg、hex70b和hex110基因表達量也顯著升高；添加1%濃度的E-β-羅勒烯可以顯著增加蜂王單側卵巢管數以及Vg、hex110兩個基因的表達量。由此可見，添加一定濃度E-β-羅勒烯可以提高蜂王的生殖潛能，這可能是由于E-β-羅勒烯的添加促進了哺育蜂的積極性，對王臺中的幼蟲飼喂更為頻繁，使幼蟲得到更多新鮮的食物，從而培育出更優質的蜂王。在后續的研究中，可在育王過程中添加E-β-羅勒烯，進一步觀察蜜蜂的哺育行為，并研究王臺中王漿量的變化。

因此，在中蜂育王過程中添加E-β-羅勒烯可以在一定程度上提高蜂王的質量，但在實際生產中的經濟效益(產漿量、產蜜量)、抗逆性、日產卵量以及維持蜂群群勢的能力等均有待進一步研究。