響應面法優化蟬棒束孢SLGY-2產孢條件

張勝蘭，鄒 曉，商勝華，于曉飛，楊茂發,*

(1. 貴州大學昆蟲研究所，貴州省山地農業病蟲害重點實驗室，貴陽 550025；2. 貴州大學真菌資源研究所，貴陽 550025；3. 貴州省煙草科學研究院，貴陽 550081；4. 貴州大學煙草學院，貴陽 550025)

昆蟲病原真菌是最早用于害蟲生物防治的病原微生物，在害蟲持續控制、環境保護以及藥品開發等方面具有獨特優勢。

蟬棒束孢菌Cordycepscicadae(Kepleretal.，2017)又被稱為蟬擬青霉(衛亞麗等，2014)，是一種重要的具有生防潛力的藥用資源菌(李忠等，2013)，可寄生膜翅目和鱗翅目中的許多昆蟲(鄧淑群，1963；陳祝安，1991)。該菌易培養，產孢量大，侵染力強，在害蟲防治上有很大的優勢(李忠等，2013)。

Yaginuma等(2002)研究蟬擬青霉對桃蛀果蛾Carposinasasakii的毒力影響時，發現此菌對桃蛀果蛾有很強的致病性，有望成為桃蛀果蛾微生物防治的制劑。劉又高等(2007)采用蟬擬青霉孢子粉處理小菜蛾Plutellaxylostella幼蟲發現，蟬擬青霉可以在小菜蛾的幼蟲和蛹上寄生，并導致其死亡。歐翔(2008)以蟬擬青霉的孢子懸液處理蠶豆蚜蟲Aphiscraccivora和小菜蛾的致死率都較高，可達88.7%。陳官菊等(2008)研究發現蟬擬青霉APC20對小菜蛾具有致病力。譚艾娟等(2009)研究發現，4株蟬擬青霉的分生孢子和菌絲對小菜蛾的致病性有一定差異。

此外，有報道表明這類真菌在黃酮類糖苷、類固醇等的生物轉化中具有潛在用途(Dymarskaetal.，2017；Ewaetal.，2018；Monikaetal.，2018)，應用前景廣闊(Qunetal.，2019)。

斜紋夜蛾Spodopteralitura屬鱗翅目夜蛾科，其具有食性雜、世代重疊、抗性強等的特點，防治難度大(羅凱等，2015；唐二平和張傳根，2017)。在各類綠色防控技術中，諸如性誘劑及使用藥劑防治害蟲均有研究報道(羅凱等，2015；唐二平和張傳根，2017)，天敵(Luoetal.，2007)、斜紋夜蛾核型多角體病毒Spodopteralituranuclepolyhedrovirus(Thomasetal.，2006)、萊氏野村菌Nomuraearileyi和斯氏線蟲Steinernemafeltiae等(宗瑞英，2016)均有成功應用報道。

據報道，棒束孢對菜青蟲Pierisrapae(代永東等，2013)、茶卷夜蛾Homonacoffearia和茶小卷夜蛾Adoxophyeshonmai(王定鋒等，2014)、小菜蛾(何勁等，2010)、埃及伊蚊Aedesaegypti(Ramirezetal.，2018)、蚜蟲Aphid(Liangetal.，2006)、二斑葉螨Tetranychusurticae(Zhangetal.，2016)等都有一定的致病性。鑒于斜紋夜蛾危害的嚴重性，蟬棒束孢屬菌株對鱗翅目等害蟲有致病性報道，本文選用一株對斜紋夜蛾相對毒力較好的蟬棒束孢菌株SLGY-2探究其固體培養條件，為今后深入研究昆蟲病原真菌棒束孢的孢子擴繁和生物防治應用做些基礎工作。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：蟬棒束孢SLGY-2。由貴州大學生命科學學院真菌資源研究所(GZAC)提供，用PDA斜面培養基于冰箱(4℃)保存。

材料：可溶性淀粉、甘油、蔗糖、麥麩、黃豆粉、酵母粉等。

儀器：人工氣候箱，恒溫培養箱，超凈工作臺，立式滅菌鍋等。

1.2 方法

1.2.1培養基配置和產孢量測定

參照沈萍和陳向東(2007)方法配置以下培養基，PDA基礎培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20 g、水1 000 mL；改良PDA培養基1：(加入碳源、氮源：可溶性淀粉、甘油、蔗糖、麥麩、黃豆粉、酵母粉各2.5 g，共15 g)；改良PDA培養基2：(加入碳源、氮源：可溶性淀粉、甘油、蔗糖、麥麩、黃豆粉、酵母粉各5 g，共30 g)；改良PDA培養基3：(加入碳源、氮源：可溶性淀粉、甘油、蔗糖、麥麩、黃豆粉、酵母粉各7.5 g，共45 g)；改良PDA培養基4：(加入碳源、氮源：可溶性淀粉、甘油、蔗糖、麥麩、黃豆粉、酵母粉各10 g，共60 g)；pH值均為自然，1×105Pa滅菌30 min。

在超凈工作臺用無菌接種環挑取培養7 d的菌種，在培養基上分別接3個點，約5 mm大??；同樣方法分別接入5種改良直徑90 mm培養基上，每個處理3個重復；接菌后在培養箱進行培養觀察(25℃)，48 h后第1次觀察記錄，之后每24 h觀察1次。第7天用十字交叉法測量菌落直徑，然后用0.05%吐溫-80無菌水洗脫培養基中的菌絲和孢子粉，刮取孢子液裝入離心管充分震蕩搖勻30 min，離心管中裝入研磨珠以充分打散孢子粉。待分生孢子完全被打散均勻后，用無菌脫脂紗布過濾，棄去雜物和培養基殘留物，配成5 mL孢子懸浮液，同樣3次重復。最后用血球計數板(25×16型)進行孢子數計數，計算產孢量。

孢子濃度計算方法：計數血球計數板4個角和中央共5個中方格(80個小方格)的孢子數，重復3次求得平均值，血球計數板(25×16型)公式：酵母細胞個數/mL=80個小方格細胞總數/ 80×400×10 000×稀釋倍數。

1.2.2不同pH值條件下產孢量測定

同1.2.1在超凈工作臺將菌株接種在PDA培養基，置于pH值分別為5.5、6.5、7.5、8.5、9.5條件的生化培養箱(T=25±1℃，RH=75%±5%，L ∶D=18 ∶6)培養。每個處理3個重復，同上觀察記錄計數。

1.2.3不同溫度條件下產孢量測定

同1.2.1在超凈工作臺將菌株接種在PDA培養基，置于溫度分別為10、15、20、25、30℃的生化培養箱(RH 75%±5%，L ∶D=18 ∶6)培養，每個處理3個重復，同上觀察記錄計數。

1.2.4不同光照時間產孢量測定

同1.2.1在超凈工作臺將菌株接種在PDA培養基，置于光照時間分別為0 h、6 h、12 h、18 h、24 h生化培養箱(25±1℃，RH 75%±5%)培養，每個處理3個重復，同上觀察記錄計數。

1.2.5響應面分析及驗證實驗

在單因素試驗條件的基礎上，選擇培養基營養成分含量、溫度、pH值、光照時間4個因素作為響應變量，按照Box-Behnken中心組合設計建立四因素三水平數學模型，以產孢量為響應值，因素與水平編碼(表1)。以Design-Expert 8.0的響應曲面法分析得出一個優化條件，重復以上培養基的制備和試驗方法，驗證試驗結果。

表1 因素與水平編碼Table 1 Coding of factors and levels

1.3 數據處理

數據采用SPSS 17.0軟件進行系統分析，Design-Expert 8.0.6.1軟件對數據進行響應面組合及方差分析。

2 結果與分析

2.1 單因素產孢量試驗結果

2.1.1不同培養基營養成分含量的產孢量

蟬棒束孢SLGY-2(PDA和改良培養基1)的培養基營養成分含量在0～15 g時，產孢量呈增加趨勢，當添加營養成分含量為30 g時，即改良培養基2中的產孢量最多，達到了5.38×108個/mL，顯著多于其他配方組，之后在營養成分含量為45～60 g時，產孢量逐漸減少(圖1)。

圖1 不同培養基營養成分含量的產孢量Fig.1 Spore yield of strain SLGY-2 of media of different nutrient components

2.1.2不同pH值產孢量的測定

在pH值為6.5時，蟬棒束孢SLGY-2的產孢量達到最大，為8.72×107個/mL，顯著高于其他pH值試驗組。在pH值7.5～9.5范圍內產孢量呈現梯度遞減，最低僅2.59×107個/mL，各pH值處理間差異顯著。pH過酸或過堿都不利于產孢，顯著低于其他試驗組；在中性值為7.5時的產孢量也未能達到最高。因此，選擇pH值為6.5較為適宜(圖2)。

圖2 不同pH值的產孢量Fig.2 Spore yield of strain SLGY-2 at different pH values

2.1.3不同溫度產孢量的測定

菌株SLGY-2產孢量在25℃條件下最高，達到3.86×107個/mL，顯著高于其他溫度條件下的產孢量。在10℃條件下的產孢量最低，但與15℃、20℃、30℃下的產孢量無顯著差異(圖3)。

圖3 不同溫度的產孢量Fig.3 Spore yield of strain SLGY-2 in different constant temperatures

2.1.4不同光照時間產孢量的測定

在全黑暗環境下不利于蟬棒束孢SLGY-2產孢。光照時長在每天6～18 h時，產孢量隨著光照時間的延長而增加；光照18 h時，產孢量達到最大值3.87×108個/mL，顯著高于其他光照時長處理。至光照24 h產孢量又稍有下降(圖4)。

圖4 不同光照時間的產孢量Fig.4 Spore yield of strain SLGY-2 in different light: dark cycle

2.2 Box-Behnken響應面試驗設計及曲面分析結果

2.2.1響應面試驗分析

響應面試驗設計結果(表2)。利用Design-Expert 8.0軟件對表2中的蟬棒束孢SLGY-2產孢量以及4個因素進行統計分析，得到各單因子的顯著性，結果如表3所示；并得到了產孢量(Y)對自變量培養基營養成分含量(A)、pH值(B)、溫度(C)以及光照時間(D)的多元二次回歸方程為：Y=6.72×108-1.05×107A+2.18×107B+1.63×107C-2.66×106D+1.50×107AB+1.86×107AC+1.07×107AD-7.20×106BC+9.39×107BD-9.84×107CD-3.18×108A2-3.05×108B2-3.12×108C2-2.64×108D2。

表2 Box-Behnken 響應面試驗設計結果Table 2 The results of Box-Behnken response surface design

響應面試驗方差分析(表3)結果可以看出，方程模型的P<0.0001<0.01，表明該方程模型極顯著，方程能很好地擬合試驗結果。失擬項P=0.9752>0.05，差異不顯著，說明該回歸模型的預測值與實測值有較好的擬合水平，該模型適用于對蟬棒束孢SLGY-2產孢條件優化分析和預測。由方差分析可知，二次項培養基營養成分含量(A2)、pH值(B2)、溫度(C2)、光照時間(D2)的P值均小于0.0001，達到極顯著水平。兩兩因素交互，pH值與光照時長(BD)和溫度和光照時長(CD)的交互作用顯著，P值都小于0.05，差異顯著。

表3 Box-Behnken 響應面試驗方差分析Table 3 Variance analysis of Box-Behnken response surface design

2.2.2響應面曲面分析

從響應面曲線及等高線圖進行分析，可以直觀看出優化區域；兩兩因素交互作用的強弱主要由響應面圖的形狀呈現出來，響應面圖形狀陡峭，表示兩因素交互作用顯著。

從響應面分析圖可以直觀看出，4個因素兩兩之間的交互作用對蟬棒束孢SLGY-2產孢量有影響，開始隨著兩因素的增加而增加，當產孢量達到極值后，逐漸減小。圖中的優化區域可以直觀看出，從而得到較高的產孢量。(光照時間-pH值)模型和(光照時間-溫度)模型的交互作用顯著(P<0.05)，隨著光照時長的增加和pH值增大，蟬棒束孢SLGY-2的產孢量也隨之增加，增加到一定程度時，產孢量有下降的趨勢；pH值和光照時長交互作用響應曲面圖(圖5A)的坡度陡，等高線圖(圖5B)呈現橢圓形，說明對該菌的產孢量亦呈現先增加后下降趨勢。隨著光照時長和溫度的增加，產孢量也隨之增加，到一定值也下降；光照時長和溫度交互作用響應曲面圖(圖6A)的坡度陡，等高線圖(圖6B)呈現橢圓形，對該菌的產孢量影響顯著。

圖5 光照時間和pH值對產孢量影響的響應面圖(A)和等高線圖(B)Fig.5 Response surface map(A)and contour map(B)of the influence of light and pH value on sporulation quantity

圖6 光照時間和溫度對產孢量影響的響應面圖(A)和等高線圖(B)Fig.6 Response surface map(A)and contour map(B)of the influence of light and temperature on sporulation quantity

2.2.3產孢條件確定及驗證

結合Design-Expert 8.0.6.1軟件對數據處理及響應值預測，對響應曲面圖和等高線分析，為驗證模型預測的準確性及產孢條件的優化，模型中產孢量優化條件為：培養基營養成分含量38.3 g、pH 6.55、25.21℃、光照18.04 h，在該培養條件下，產孢量達到5.70×108個/mL。本研究實際試驗測定設定培養基營養成分含量38 g、pH 6.5、25℃、光照18 h驗證，重復3次，產孢量的值為5.70(±0.49)×108個/mL。實際測定結果與模型優化條件結果基本相符，可以證明響應面法優化蟬棒束孢SLGY-2產孢條件具有可行性。

3 結論與討論

微生物的生長需要碳源、氮源以及適宜其生長的環境條件(張文芝和郭堅華，2013)。從本研究結果來看，不同培養基和生長條件對真菌產孢量有較大影響。本試驗通過單因素試驗和響應曲面分析法對目標菌株蟬棒束孢SLGY-2的培養條件優化。

陳祝安等(1990)采用煮熟的小麥、大麥以及玉米、豆餅、麩皮和谷殼等進行室溫固體發酵發現，培養基中的碳源、氮源影響蟬擬青霉的產孢量和孢梗束的生長。狄雪塬(2015)等選用不同培養基配方，YS03球孢白僵菌產孢量最大。本研究在單因素條件中不同培養基營養成分含量在30 g時，可獲得最高的產孢量(5.38×108個/mL)。單因素條件選用不同碳源和氮源按1 ∶1的比例，按不同添加量對培養基進行改良。但未對不同碳源和氮源按不同比例對產孢量的影響進行研究，有待繼續探索不同比例和不同用量對產孢量的影響。

李忠(2013)對蟬棒束孢LB菌株液體培養特性研究時發現，培養液的pH值影響蟬棒束孢菌絲生長。本實驗也發現適宜產孢的最佳pH值為6.5，pH值在4.5時，培養基不凝固，不能進行接菌培養；當pH值在9.5時培養基凝固，但蟬棒束孢SLGY-2生長緩慢且產孢極少；偏酸或偏堿性都不利于產孢。適宜溫度為25℃，與許明敏(2012)以Richard液為培養基25℃適宜產孢相近；當溫度低于15℃或高于30℃時菌株生長慢且未能見明顯孢子粉，不利于產孢。全黑暗時產孢也未見明顯孢子粉，最適光照時間為18 h，光照時長影響蟬棒束孢產孢量。結合響應曲面分析法對蟬棒束孢SLGY-2的培養條件進行探究，產孢量較單因素的條件有所提高。

本文從固體培養條件的優化對其產孢量的影響進行探究，運用響應曲面分析法探究培養基營養成分含量、pH值、溫度以及光照時間4個因素對蟬棒束孢SLGY-2產孢量的影響。經過響應曲面分析產孢量最優組合：培養基營養成分含量38.3 g、pH 6.55、25.21℃、光照18.04 h。適宜于為進一步探究蟬棒束孢固體培養條件的優化。