蜜蜂殘翅病研究進展

丁兆潤，韓日疇，張 祎*

(1, 華南農業大學農學院，廣州 510640；2, 廣東省科學院動物研究所，廣東省動物保護與資源利用重點實驗室，廣東省野生動物保護與利用公共實驗室，廣州 510260)

蜜蜂屬于膜翅目Hymenoptera蜂科Apidae，分布于世界各地，不僅生產蜂蜜、蜂膠、蜂王漿以及其它蜂產品，更是重要的授粉昆蟲，對全球農業經濟發展起到舉足輕重的作用。然而，越冬蜂群的消失(Overwintering Colony Loss，OCL)和蜂群崩潰綜合癥(Colony Collapse Disorder, CCD)現象的出現(Dennisetal., 2007)，引起了人們對蜜蜂的健康和生存的重視。蜂群的消失與棲息地、農藥、害蟲和病毒等多方面因素有關，蜜蜂的減少不僅會影響作物授粉,對糧食安全產生威脅，還會對植物多樣性及生態平衡帶來不利影響(Pottsetal., 2010)。

蜜蜂殘翅病病毒(Deformed Wing Virus, DWV)是西方蜜蜂Apismellifera中最常見的病毒。其危害蜜蜂的典型特征是成年蜜蜂翅膀畸形、腹部縮短腫脹、行動乏力和幼蜂迅速死亡(de Miranda and Genersch, 2010)。在沒有狄斯瓦螨Varroadestructor的情況下，蜂群中DWV病毒水平低，呈無癥狀感染。在狄斯瓦螨寄生的蜂群中，DWV滴度明顯上升，呈顯性癥狀感染，群勢削弱，甚至死亡消失(Kovac and Crailsheim, 1988;de Miranda and Genersch, 2010)。DWV和狄斯瓦螨的相互作用導致西方蜜蜂大量消失的現象，受到世界蜜蜂學家的廣泛關注。DWV是單鏈RNA病毒，基因組約10 kb, 感染力強，易變異，在狄斯瓦螨的媒介作用下，不斷擴大著寄主范圍，并且演化出新的變異體，DWV-A、DWV-B和DWV-C (Ongusetal., 2004; Zionietal., 2011; Mordecaietal., 2016a)。本文將從DWV的生物學、流行病學、病理學和防治技術4個方面進行綜述。

1 生物學

1.1 病毒結構

根據國際病毒分類委員會(ICTV)分類，DWV屬于小核糖核酸病毒目Picornavirales傳染性軟化病毒科Iflaviridae，傳染性軟腐病病毒屬Iflavirus(Vallesetal., 2017)。如圖1所示，DWV是單鏈正鏈RNA病毒，其基因組是單順反子，總長度為10 140 bp(不含PolyA長度時)，僅有一個連續開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)。基因組的5′UTR長1 144 bp，3′UTR長338 bp，5′UTR 和3′UTR都參與了基因組的復制和翻譯。N端包括核糖體翻譯起始位點(Internal Ribosome Entry Site，IRES)和先導蛋白(Leader protein，Lp)以及4個結構蛋白，VP1(44 kDa)、VP2(32 kDa)、VP3(28 kDa)和VP4。C端包括RNA解旋酶(Helicase)、病毒基因組連接蛋白(Viral Protein genome linked，VPg)、3C-蛋白酶(Chymotrypsin-like 3C protease，3C-pro)以及RNA聚合酶(RdRp)，其末端有多聚A尾巴(PolyA)(Lanzietal., 2006; Nakashima and Uchiumi, 2009; Dalmonetal., 2017)。

DWV的5′端與Iflaviridae屬的其他病毒相比，具有高度的多樣性(Murakamietal., 2014)。5′UTR有一個類似四葉草形狀的二級結構IRES，與翻譯的啟動有關。IRES的存在使得許多小核糖核酸病毒目病毒可以通過阻斷帽子依賴(Cap-dependent)的翻譯起始，從而抑制宿主細胞蛋白的合成，但不影響病毒蛋白的合成，這有利于病毒應對宿主防御機制(Fernándezetal., 2013)。Lp具有多種功能，包括蛋白酶活性，在氨基酸水平高度可變。有研究發現DWV與其變異體VDV-1差異最大位置是Lp，同源性最低只有73.9%(Dalmonetal., 2017)。VPg不僅有穩定基因組的作用，還參與了復制和翻譯等過程(Hébrardetal., 2009)。3′UTR區域高度保守，末端以共價的方式連接PolyA，PolyA的長度由遺傳決定。圖1顯示核苷酸標度及各元件相應核苷酸數量；非結構蛋白在上方，結構蛋白在下方；箭頭表示一些關鍵的重組區域，包括DWV基因組Helicase、5′UTR 和Lp編碼的區域。

圖1 DWV基因組的示意圖Fig.1 Schematic diagram of DWV genome注：根據文獻 Lamp et al., 2016和Dalmon et al., 2017修改。

通過冷凍電子顯微鏡(Cryo-Electron Microscopy)和X射線晶體學發現DWV是輕微的橢球體結構，其直徑約30 nm，病毒衣殼為對稱的偽T3二十面體，不含脂膜(kubníketal., 2017)。結構蛋白VP1、VP2和VP3的亞基排列成原聚體，在衣殼蛋白上每5個原聚體形成一個單位，五聚體的封閉和開放控制著病毒的釋放過程(Organtinietal., 2017)，衣殼蛋白在保護病毒RNA不被RNA酶降解和確定病毒宿主的特異性等方面也起著重要作用。當環境pH改變或者在高濃度的非生理性離子條件下，DWV的衣殼三維結構會發生變化，特別是衣殼蛋白VP3的C末端延伸在病毒表面形成的p-結構域，表現為突出球狀延伸；病毒衣殼構象的變化，可能會產生新的催化位點，從而影響病毒進入宿主細胞(Organtinietal., 2017;kubníketal., 2017)。Picornavirales的大多數病毒基因組編碼的小蛋白VP4已經被證明參與了細胞膜通透性的改變，例如吸血獵椿病毒(Triatoma Virus，TrV)的VP4小蛋白插入膜中，形成新的蛋白通道，而當pH值越高時，膜的滲透性也越高(Sánchez-Eugeniaetal., 2015)，DWV中的VP4小蛋白也可能影響著膜的透性。

1.2 病毒變異及進化關系

RNA病毒具有很高的突變率，變異后的毒株共同存在并感染寄主的現象是病毒感染的特征之一，影響著病毒的復制、傳播和疾病誘導等過程。目前發現DWV主要有3種基因型：DWV-A、DWV-B和DWV-C (Lanzietal., 2006; Zionietal., 2011; Mordecaietal., 2016a)。

圖2-a顯示了基于RdRp的氨基酸序列保守區域的貝葉斯系統進化推理，節點上顯示貝葉斯支持值。根據系統發育學分析，DWV各基因型的親緣性不同，DWV-A與DWV-B親緣性較近，屬于同一分支，DWV-C雖然與DWV-A和DWV-B不屬于同一分支，但相比于囊狀幼蟲病毒(Sacbrood Bee Virus，SBV)，與DWV-A和DWV-B的親緣性更近。

DWV最初基因，現在稱為DWV-A基因型，包括先前大部分DWV序列和Kakugo病毒(KV)(Lanzietal., 2006)。通常，在無狄斯瓦螨的蜂群中，DWV表現為低水平，無癥狀感染，然而狄斯瓦螨存在時，會導致DWV的載量顯著增加，流行率上升，呈現明顯癥狀(Ryabovetal., 2014)。早先研究發現，誘導顯性感染的狄斯瓦螨體內的DWV水平，遠高于誘導隱形感染的狄斯瓦螨的DWV水平，暗示著DWV在狄斯瓦螨體內復制到一定閾值，才能表現出致病癥狀(Gisderetal., 2009)。而其他的研究則發現狄斯瓦螨體內的DWV水平呈高度動態，主要由狄斯瓦螨取食過程決定，而不是依賴狄斯瓦螨體內的復制。取食低DWV-A水平蜂蛹的狄斯瓦螨傳代后，子代螨傳播DWV-A的能力下降，說明DWV-A進化更傾向于寄生蜜蜂，而不是寄生狄斯瓦螨(Posada-Florezetal., 2019)。

DWV-B包括狄斯瓦螨病毒(VDV-1)以及VDV-1-DWV重組體。VDV-1是從狄斯瓦螨組織中分離到的類病毒，與DWV具有84%的核苷酸同源性，差異主要集中在5′UTR區域。VDV-1能和DWV共同感染蜜蜂，并與DWV-A發生基因重組，產生重組體VDV-1-DWV，VDV-1-DWV是強毒株型，導致蜜蜂殘翅(Ongusetal., 2004; Zionietal., 2011)。

蜂群中一種基因型的流行導致了另一種基因型不占優勢，這種現象叫“重復感染排除”，新產生的變異體一定程度上保護了蜂群(Mordecaietal., 2016b)。例如，DWV-B的出現與狄斯瓦螨的流行關系密切，并且因為狄斯瓦螨的存在導致了病毒遺傳多樣性的快速下降 (Martinetal., 2012)。然而關于DWV多樣性變化以及變異體之間相互排斥、相互競爭的觀點還存在爭議。病毒與宿主之間始終是在相互適應，不斷進化的過程中。有研究發現，即使在有狄斯瓦螨的蜂群中，依然存在DWV的高度多樣性。通過反向遺傳學實驗發現，不同變異體的復制頻率相似，而且廣泛存在重組現象，但缺乏協同效應和排斥競爭效應，這種病毒高度共存的現象，是DWV不斷適應宿主的結果，有利于病毒形成抗RNA干擾能力，來應對宿主的防御機制(Ryabovetal., 2019)。

DWV-C與前面描述的DWV-A和DWV-B不同，是一個新的、獨立的分支。從英格蘭南部德文郡地區的蜂群中，采集經歷越冬群落損失后存活的無癥狀蜜蜂樣本，進行雙末端測序，發現新的DWV變異體，命名為DWV-C (Mordecaietal., 2016a)。

圖2-b顯示了DWV變異體的同源百分比單位矩圖：氨基酸(下劃橫線)；核苷酸(無下劃橫線)。DWV-C與DWV-A和DWV-B在核苷酸序列和氨基酸序列都存在差異，并且存在A型與C型重組或者B型與C型重組現象。在蜜蜂蜂群中，狄斯瓦螨傳播的DWV變異體主要是B型，而與C型無關。而對歐洲越冬消失的蜂群樣本進行DWV三種變異體檢測發現，DWV-C是越冬蜂群消失最后一個月的優勢基因型，暗示著DWV-C影響著越冬蜂群消失(Kevilletal., 2017)。更多地區的樣本調查顯示，DWV-C在流行性和病毒載量方面，與DWV-A和DWV-B相比，呈較低水平(Kevilletal., 2019)。然而，在調查巴西的無刺蜂Meliponasubnitida蜂群時發現，蜂群廣泛存在DWV-C，且表現為顯性變異，這表明不同的寄主生物對不同DWV變異體的敏感性可能不同，這也影響著DWV變異體在不同寄主間的流行情況(de Souzaetal., 2019)。

圖2 三種基因型的進化關系及同源性Fig.2 Phylogeny and homology analysis of three genotypes注：根據文獻Mordecai et al., 2016a和 Martin and Brettell, 2019修改。

1.3 DWV的研究方法

1.3.1DWV病毒粒子形態觀察

DWV是RNA病毒，有變異、重組以及隱形感染現象，診斷存在困難。與其他病原體相比，DWV的顆粒極其微小，普通的光學顯微鏡無法觀察，通過透射電鏡，才能觀察到純化后病毒顆粒的形態特征，然而這只能較為精確地測定DWV的大小、形狀及相對位置，結合X射線晶體學才能夠進一步分析DWV的三維結構(kubníketal., 2017)，但還無法精確區分病毒的種類。

病毒粒子的形態觀察建立在病毒粒子的分離純化基礎上，氯化銫濃度梯度超速離心法是分離純化蜜蜂病毒的常用技術，具體步驟如下(Fannon and Ryabov, 2016)：

1)收集5 g蜜蜂(一般采集癥狀明顯、發育不良的殘翅成年蜜蜂比較容易分離到病毒粒子)，在研缽中加入35 mL PBS緩沖液(100 mM PBS，0.05% Tween-20，pH 7.4)，研磨均勻。

2)4℃，10 000 rpm離心12 min。去除上層脂質層和底部未完全研磨組織顆粒層，保留中間層。

3)準備一個30 mL離心管，里面加入 2.5 mL 20%蔗糖溶液(蔗糖用PBS緩沖液配制)，隨后加入上述中間層溶液，不要混勻，置于上層，這樣超速離心過程中上層中的病毒粒子可以穿過0.5 cm的蔗糖層到達底部。

4)18℃，28 000 rpm離心3 h 30 min(SW28 Beckman 角轉頭)。棄上層，收集底部沉淀，重懸于2 mL PBS緩沖液，4℃過夜，以便充分重懸病毒粒子。

5)制備氯化銫梯度溶液。35 mL超速離心機專用離心管，從底部往上依次加入5 mL密度為1.6 g/cm3、1.5 g/cm3、1.4 g/cm3、1.3 g/cm3和1.2 g/cm3。不同密度的氯化銫溶液都是加PBS緩沖液稀釋飽和氯化銫溶液而得。最后將上一步所得的病毒粒子溶液加在最上層。

6)4℃，28 000 rpm離心18 h(SW28 Beckman水平轉頭)。

7)收集每個間隔層的1.5 mL溶液，主要可能存在于1.3～1.4 g/cm3的間隔層，混合所有收集到的溶液，用PBS緩沖液稀釋5～10倍。

8)4℃，28 000 rpm離心3 h(SW28 Beckman 角轉頭)，收集底部沉淀，重懸于200 μL 0.1M，pH 7.4的PBS緩沖液。-80℃保存備用。

1.3.2DWV的分子鑒定

通過電鏡觀察到病毒顆粒的形態特征后，還需要分子生物學技術來明確病毒的種類。免疫學檢測是利用針對病毒衣殼蛋白高度特異性抗體作為探針，來定性和定量檢測病毒。目前，多采用酶聯免疫技術來檢測DWV，然而這種方法只適用于檢測高濃度的DWV，當不同病毒的基因同源性較高時，免疫學檢測的特異性較差。利用分子技術檢測不同病毒核苷酸序列的差異，可以準確地鑒定出病毒的種類。

在蜜蜂殘翅病的診斷中，反轉錄聚合酶鏈式反應技術(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)應用最廣泛。RT-PCR將RNA的反轉錄和cDNA的聚合酶鏈式擴增(PCR)相結合，是一種針對目的產物RNA的核酸分子檢測技術。其原理是RNA單鏈在逆轉錄酶的作用下合成互補DNA(cDNA)，隨后以cDNA為模板，在引物和DNA聚合酶的作用下，不斷進行目的基因的循環擴增，因此可以檢測較低水平的DWV樣本，具有很高的靈敏性(Lanzietal., 2006)。

隨著分子技術的發展，新的PCR技術也不斷應用于蜜蜂病毒病的診斷，如定量PCR(Quantitative PCR)能對DWV等RNA病毒濃度進行定量檢測，來研究病毒載量與危害癥狀的關系(Highfieldetal., 2009)；多重PCR(Multiplex PCR)可以同時檢測多重病毒(Sguazzaetal., 2013)，提高檢測的效率；巢氏PCR(Nested PCR)通過兩輪PCR來提高反應的特異性(Fannon and Ryabov, 2016)。目前，基于PCR的核酸分子檢測技術相比于傳統免疫學檢測技術，具有高效、精確和低成本等優勢，已廣泛應用到蜜蜂病毒學的研究工作中。高通量測序是目前用于發現新病毒的主要技術，DWV的幾種變異體都是通過高通量測序而發現的(Mooreetal., 2011)。

1.3.3DWV的體內復制示蹤

為研究DWV的致病機制，需要研究病毒在體內的分布復、制繁殖以及對組織細胞的危害。鏈特異性逆轉錄(Strand specific RT-qPCR)是用于特異性檢測病毒的反義鏈，結合TaqMan定量PCR技術則可以方便的檢測到DWV是否在宿主體內復制及其繁殖量(Boncristianietal., 2009)，但是無法直觀觀察病毒在宿主的具體組織和具體位置的復制繁殖。利用原位雜交技術(In-situ hybridization)可檢測DWV在蜜蜂大腦內的復制，分別使用正鏈和反義鏈探針，檢測DWV的反義鏈基因組和正鏈基因組，結果顯示在視覺神經網、蘑菇體和觸角神經葉都檢測到DWV正鏈信號，同時也都有稍弱的反義鏈信號，說明DWV在蜜蜂大腦內成功復制繁殖(Shahetal., 2009)。而免疫組化技術也應用到檢測DWV是否在狄斯瓦螨體內繁殖，結果沒有在狄斯瓦螨的組織內檢測到DWV特異性反應指示信號，只在中腸腔內的糞便上檢測到(Teresaetal., 2008)。以上技術都非常確定可以檢測DWV反義鏈，說明DWV確實發生了復制和繁殖，但是都殺死了目標昆蟲，是在非活體組織上研究。如何能夠在活體觀察DWV的繁殖呢？2019年，通過構建重組DWV基因組并在起始位置加上eGFP標記蛋白，可以非常直觀的在熒光顯微鏡下觀察DWV的去向以及復制增殖(Ryabovetal., 2020)。這項技術是美國農業部蜜蜂研究所(USDA-ARS，Bee Research Lab)的最新研究結果。

1.3.4DWV基因組體外重組

由于缺乏細胞培養體系、血清學試劑、特定病毒株或克隆株，盡管經過了幾十年的深入研究，到目前為止，所有的研究都使用了直接從蜂箱采集的受感染的蜜蜂模型和病毒分離物。

多個病毒株、主變異體甚至種可能同時出現在這些分離物中，因此可能會得到一些錯誤的結論。構建體外重組病毒(反向遺傳學)則可以繞過病毒分離和純化，在細胞克隆培養系統中生產克隆病毒。有實驗選擇DWV-A 1414株作為目標病毒株，根據Genebank中4個DWV-A的基因組序列(AJ489744、AY292384、JQ413340、AB070959)設計了28條引物。首先使用巢式RT-PCR分段獲得基因產物并測序驗證序列，然后分別獲得5′端和3′端兩個有重疊區域的大片段，最后設計一對可擴增全基因組的引物，使用One-Step RT-PCR擴增獲得全長。隨后將純化的10 164 bp DWV-A的全長序列插入到pBR322載體，轉化大腸桿菌HB101菌株。在構建過程中，還在適當的位置插入了酶切位點，從而提取質粒后可以通過酶切獲得線性化病毒用于后續研究(Lampetal., 2016)。應用該方法還能構建了多個DWV克隆珠系，研究這些混合株系在同一個蜜蜂中的復制動態(Ryabovetal., 2020)。該技術的應用與發展為病毒的感染與致病機理研究奠定基礎。

2 流行學

2.1 DWV的發現歷史及寄主范圍

1977年，人們在無癥狀的埃及蜜蜂身上首次分離出DWV，但誤認為DWV是埃及蜜蜂病毒(Egypt Bee Virus，EBV)(Baileyetal., 1979)。1982年在日本畸形成年蜜蜂身上也分離出DWV，通過在血清學分析發現DWV與EBV雖存在親緣性，但親緣關系較遠。由于這種分離出的病毒使成年蜜蜂表現出翅膀殘缺癥狀，因此被命名為殘翅病病毒(DWV)(Bailey and Ball, 1991)。DWV最初被發現危害英國、拉丁美洲和南非等國家和地區的蜜蜂種群(Allen and Ball, 1996)，但隨著狄斯瓦螨的傳播，DWV的流行范圍不斷擴大(Ryabovetal., 2014)，成為目前最流行的蜜蜂病毒，對32個國家的調查顯示，蜂群中DWV的平均感染率至少為55% (Martin and Brettell, 2019)。盡管DWV的毒力相對較低，但在狄斯瓦螨侵染過的蜜蜂中，DWV是持續增殖的，一旦感染就可能爆發，導致成蜂殘翅以及蜂群損失(Schroeder and Martin, 2012; Mondetetal., 2014)。

目前，DWV的宿主涵蓋了10個目的68種節肢動物，其中64種節肢動物屬于昆蟲綱Insecta，包括膜翅目Hymenoptera、半翅目Hemiptera、鞘翅目Coleoptera、雙翅目Diptera、鱗翅目Lepidotera、革翅目Dermaptera和蜚蠊目Blattodea 7個目。4種節肢動物屬于蛛形綱Arachnida，包括蜱螨目Arachnoidea、蜘蛛目Araneae和盲蛛目Opiliones 3個目(Martin and Brettell, 2019)。

2.2 DWV的傳播特征

DWV作為一種專性寄生性生物，其生存依賴于活體宿主細胞的生命機制。為了不斷繁殖，DWV需要從一個寄主傳播到另一個寄主。DWV的傳播包括了水平傳播與垂直傳播。傳播方式決定著DWV的存在水平以及增殖速度，進而影響著DWV的毒力大小以及流行情況，最終表現在對寄主危害程度和宿主范圍大小的變化。

2.2.1水平傳播

2.2.1.1 食物源-消化道傳播

食物源-消化道傳播是指DWV寄主在食用受污染的食物或者通過消化道排出有病毒的糞便后，發生病毒傳播和感染的現象。不管是蜜蜂的食物來源如蜂蜜、蜂王漿、花粉等，還是蜜蜂體內的胸腺、下咽腺、中腸等部位，以及蜜蜂排出的糞便，均檢測到DWV陽性，暗示著在蜜蜂取食、喂食、護理幼蟲或者清理巢房時，會發生DWV的水平傳播(Yue and Genersch, 2005；Singhetal., 2010)。

花粉是蜜蜂生長發育的主要蛋白質來源，對蜜蜂的營養代謝有著重要影響。通常情況下，未被蜜蜂采集的花粉不存在DWV，而蜜蜂采集后的花粉檢測到DWV存在，說明DWV的水平傳播可以通過傳粉昆蟲的訪花過程發生(Mazzeietal., 2014)。花粉中蛋白質與脂類的比例不同，也影響著傳粉昆蟲的覓食偏好性((Vaudoetal., 2016)，從而影響了DWV的水平傳播速率。

螞蟻是DWV的寄主之一，與DWV的食物源傳播也有著密切關系。野外的螞蟻Myrmicarubra經常取食死亡的蜜蜂，而死亡的蜜蜂體內很有可能攜帶DWV (Schl?ppietal., 2019)，暗示著食物源傳播是DWV跨物種水平傳播的機制之一。

2.2.1.2 媒介傳播

DWV的最初寄主是西方蜜蜂，在蜂群中致病力較弱，存在水平較低，呈隱性感染存在。而狄斯瓦螨最初寄主是東方蜜蜂Apiscerana，因其傳播到西方蜜蜂蜂群，才改變了DWV流行程度及其多樣性，成為DWV最主要的傳播媒介(M?ckeletal., 2011; Wilfertetal., 2016)。一方面，狄斯瓦螨本身的寄生行為，影響著蜜蜂的健康及生理狀態(張祎和韓日疇, 2012)；另外一方面，狄斯瓦螨的取食行為，使DWV跨越體壁或圍食膜等生理障礙，直接傳播到蜜蜂的血淋巴，導致蜜蜂的DWV水平上升。雖然DWV能否在狄斯瓦螨體內復制尚存在爭議，但因狄斯瓦螨寄生和取食的特性，直接導致了蜂群中DWV的快速流行以及多樣性的下降，并且通過蛋白組學，也證明狄斯瓦螨體內并沒有進行DWV的復制，所以DWV的多樣性主要取決于傳播途徑而不是是否在狄斯瓦螨體內增殖(Ryabovetal., 2014; Erbanetal., 2015)。DWV還以狄斯瓦螨為媒介，實現跨物種水平傳播，如Bombuspascuorum和Bombusterrestris等大黃蜂的蜂群已存在DWV的流行，并且發生著DWV的不同變異體的流行性以及毒力的改變(Manleyetal., 2019)。

此外，梅氏熱厲螨Tropilaelapsmercedesae是蜜蜂的另外一種寄生螨，也是攜帶和傳播DWV的媒介，梅氏熱厲螨可能成為DWV流行的新載體(Khongphinitbunjongetal., 2016)。

2.2.1.3 體表傳播

蜜蜂是一種會飛行的群居性昆蟲，蜂巢內龐大的蜜蜂數量和個體間頻繁的身體接觸極易導致蜜蜂病毒的傳播。冬季是蜜蜂休憩的季節，然而由于冬季環境溫度較低，蜜蜂不得不聚集在一起以保存和提高熱量，保持代謝率。蜜蜂身體接觸的過程中，很容易出現表皮破損，如體表絨毛掉落，這有利于病毒從傷口進入蜜蜂體內，進而導致病毒在蜂群中的流行，這也是冬季蜂群消失的原因之一。而蜂群密度過大時或者在外界蜜源缺乏出現盜蜂時，同樣會增加蜜蜂個體的身體接觸，導致DWV的快速流行，因此，適當的分蜂處理，有利于抑制蜜蜂病毒在蜂群中傳播(Bailey and Ball, 1991)。

2.2.2 垂直傳播

垂直傳播是由親代傳播到子代的一種傳播方式。研究發現，盡管蜂王與雄蜂都表現為健康狀態，但在蜂王卵巢和雄蜂精囊卻檢測到了DWV，暗示DWV垂直傳播的可能。實驗室利用人工授精的方式，用DWV陽性精子與蜂王DWV陰性的卵子結合，或者DWV陰性精子與蜂王DWV陽性的卵子結合，均產生了DWV陽性的受精卵，發育為感染DWV的工蜂。DWV陽性未受精的卵也可直接發育為感染DWV的雄蜂，即DWV可以通過父系或母系，垂直傳播給后代(Yueetal., 2007; de Miranda and Fries, 2008)。

通過自然交配的方式，受感染的雄蜂能與正常的雄蜂競爭，并與蜂王交配，使蜂王攜帶DWV。蜂王交配后的DWV載量明顯高于未交配的對照組，并且DWV主要存在于腹部和胸腔，而頭部、卵巢、精囊和精子的病毒載量較低，暗示DWV存在垂直傳播的途徑，但主要依賴水平傳播 (Amirietal., 2016)。

DWV的垂直傳播可進一步分為病毒在卵表面傳播的經卵傳播和病毒在卵內傳播的經卵傳播。研究發現，發現卵感染DWV的水平與蜂王巢房感染DWV的水平存在正相關關系，而當蜂王感染DWV水平較低時，則通常無法檢測到卵含有DWV。對卵表面進行漂白劑處理以及無菌水清洗后，發現DWV的濃度相對于未處理的空白對照顯著下降，表明DWV的垂直傳播更多依賴于卵表面傳播，而不是卵內傳播(Amirietal., 2018)。

寄主在感染DWV后，體內轉錄反應會發生變化，如免疫系統基因的表達或抑制，進而適應DWV不同的傳播方式。通過對相關基因的定量檢測，或許更有利于理解DWV的水平傳播與垂直傳播以及這些途徑對宿主帶來的影響(Ryabovetal., 2016)。

3 病理學

3.1 DWV對蜜蜂的危害

DWV是引起蜜蜂感染后具有明確疾病癥狀的幾種蜜蜂病毒之一。DWV感染的典型癥狀包括成年蜜蜂翅膀皺縮、體型縮小和變色，蛹發育緩慢和幼蜂迅速死亡等(Kovac and Crailsheim, 1988;de Miranda and Genersch, 2010)。DWV感染蜜蜂后，在蜜蜂大腦負責視覺和嗅覺等關鍵區域復制，最終導致蜜蜂行為異常(Shahetal., 2009)。DWV不僅感染蜜蜂的大腦，還感染分泌腺和脂肪體(Fujiyuki etal., 2009)，而脂肪體對昆蟲的新陳代謝、免疫和信息素的產生起著重要的作用。

比較分析DWV感染的癥狀蜜蜂與無癥狀蜜蜂，發現有癥狀的蜜蜂觸角中含有大量的DWV，病毒衣殼在蜜蜂觸角上皮區域聚集，呈晶體狀排布，而且感染的區域完整性也受到破壞，暗示著觸角的功能受損，進而影響蜜蜂的交流(Kimetal., 2019)。DWV還損傷蜜蜂神經元，促使工蜂過早成熟，過早地從內勤蜂轉變為采集蜂(Tranielloetal., 2020)。DWV的復制水平影響著蜜蜂的壽命，與蜜蜂越冬群體的損失有著很強相關性，有實驗表明，冬季蜜蜂DWV載量增加，與參與細胞免疫的基因表達減少有關，導致了蜜蜂對DWV的易感性，最終危及越冬蜜蜂群體(Steinmannetal., 2015)。DWV對蜂蛹表現出低毒性，感染了高水平DWV的蜂蛹，仍然能正常發育，死亡率較低(Remnantetal., 2019; Teheletal., 2019)。

3.2 DWV的致病機理

3.2.1DWV與媒介的協同作用

生物因素和非生物因素的脅迫增加著蜜蜂感染病毒的風險，除了溫度變化和蜜蜂自身群體的強弱影響著蜜蜂對病毒的抵抗力外，狄斯瓦螨的媒介作用直接改變了蜂群中DWV的傳播情況 (Priscoetal., 2011)。有研究從動態學的角度，建立模型來闡述蜜蜂-DWV-狄斯瓦螨三者的相互關系 (Kangetal., 2016)，而狄斯瓦螨與DWV的協同關系包括影響著病毒癥狀的顯隱性、DWV的復制水平和流行率以及蜜蜂的免疫反應等方面。

病原寄生于寄主，有兩種表現方式：隱性感染和有癥狀的顯性感染。表現為哪種感染，與病原的載量、毒力、傳播途徑以及寄主的免疫反應等多方面因素有關(Sorrelletal., 2009; Rigaudetal., 2010)。在沒有狄斯瓦螨的情況下，DWV在蜂群中通常呈低水平，表現為隱性感染(Shutleretal., 2014; Robertsetal., 2017)。相反，在存在狄斯瓦螨的蜂群中，DWV在蜂群中通常呈高水平，感染DWV的成蜂出現翅膀殘缺、壽命縮短等癥狀，以及冬季蜜蜂種群損失現象，表現為顯性感染(Dainatetal., 2012; Wuetal., 2017)。

DWV可以感染西方蜜蜂的雄蜂及各個齡期的工蜂，DWV的滴度從低到高依次是正常成年雄蜂、正常成年工蜂、幼蟲、殘翅成年蜂、蛹(Chenetal., 2005)。而狄斯瓦螨的存在不僅導致蜜蜂體內DWV滴度的不斷增加、蜜蜂種群中DWV的流行率陡增，還導致DWV多樣性的大量減少，最終形成DWV單一優勢和高致病性(Martinetal., 2012)。狄斯瓦螨的唾液中存在毒性蛋白(Varroatoxic protein，VTP)，在缺乏DWV的情況下能直接殺死東方蜜蜂的幼蟲和蛹，其重組表達的VTP能引起DWV滴度的升高和成蜂翅膀的不正常發育(Zhang and Han, 2018)。

關于DWV與狄斯瓦螨的協同作用對免疫系統的影響，目前還存在爭議。有研究認為感染DWV后的蜂蛹，因狄斯瓦螨的誘導而產生免疫抑制，有利于DWV進一步復制(Yang and Cox-Foster, 2005)。其他實驗也發現狄斯瓦螨通過干擾NF-kb信號途徑，抑制了體液免疫和細胞免疫，從而促進了螨的繁殖，這也暗示著狄斯瓦螨與DWV之間存在互利共生的關系(Di Priscoetal., 2016)。然而，相反的觀點則認為隨著狄斯瓦螨數量的增加，免疫反應可能會被激活(Zhangetal., 2010)。對蜜蜂進行實驗性創傷后，檢測到蜜蜂DWV滴度上升和相關的免疫基因表達上調，這表明狄斯瓦螨吸食血淋巴并不會抑制蜜蜂的免疫系統；相反，蜜蜂免疫基因表達增加，一定程度上抑制了狄斯瓦螨的繁殖(Kusteretal., 2014)。蜜蜂對DWV與狄斯瓦螨的免疫反應可能不呈持續穩定狀態，初始DWV的水平較低，這是由于Toll途徑轉錄因子和其他免疫效應分子的高水平表達，但這種表達是暫時性的，伴隨著這些途徑的下調，DWV開始不斷地復制(Zhaoetal., 2019)。

3.2.2DWV與殺蟲劑的協同作用

農藥，特別是以神經系統為靶標殺蟲劑，如新煙堿類農藥，在防治螨類的同時，對蜜蜂這類傳粉型昆蟲，不僅有著直接致命影響(Samuelsonetal., 2016)，還能與DWV產生協同作用，間接加重對蜜蜂的危害。研究發現死亡的蜜蜂中殺蟲劑的含量與DWV等病毒的流行率呈正相關，這意味著殺蟲劑可以協同并加重DWV對蜜蜂健康的危害，威脅蜂群的生存(Martinelloetal., 2017)。病毒與殺蟲劑在蜜蜂上的協同作用關系比較復雜：殺蟲劑可能成為病毒復制的加速因子，導致病毒大量擴增，進而危害蜜蜂(Diaoetal., 2018)，但更高的殺蟲劑劑量不意味著一定會引起更高的病毒滴度，而是通過對昆蟲免疫信號的負調節作用，來降低蜜蜂對病毒感染的耐受度(Di Priscoetal., 2013; Coulonetal., 2018)。

3.2.3DWV與其他病原體的共同感染

蜂群同時感染多種病原體是非常普遍的現象(Granbergetal., 2013)。當兩種病原體同時感染宿主時，可能是互利關系(Positively)也有可能是競爭關系(Negatively)或者互不影響(Independently)。

微孢子蟲Nosemaceranae是一種干擾蜜蜂蛋白質代謝的專性寄生蟲。最初的研究發現微孢子蟲與DWV共同感染存在拮抗作用，這兩種病原體在蜜蜂的中腸呈顯著的負相關，但在蜜蜂頭部或胸部，兩者沒有表現出相關性(Costaetal.,2011)。之后在蜜蜂中腸的實驗，進一步證明微孢子蟲與DWV呈不對稱的競爭關系，且不利于DWV的繁殖。如果蜜蜂先感染DWV，微孢子蟲能夠正常繁殖，但如果蜜蜂先感染微孢子蟲則抑制DWV的增殖(Doubletetal., 2015)。微孢子蟲與DWV的共同感染影響，還與營養物質有關。在沒有花粉的條件下，微孢子蟲的感染提高了蜜蜂體內的DWV水平，但有花粉的條件下，感染微孢子蟲的蜜蜂與沒感染微孢子蟲的蜜蜂相比，DWV水平沒有顯著差異，暗示著營養物質能減少病原體寄生的影響，或者提高蜜蜂的免疫力(Zhengetal.,2015)

花卉是蜂類采蜜和傳粉的主要植物，也是各種病原體的寄主。蜂類在訪花過程中，受到多種病原體的共同感染，使蜂群的數量和豐富度迅速下降(Sachman-Ruizetal., 2015)。DWV在不同的植物物種間分布不均勻，DWV如何通過花傳播和擴散，取決于植物的性狀、病毒株的傳染性、寄主免疫能力以及昆蟲覓食行為等(Algeretal., 2019)。

3.2.4DWV與營養物質的關系

DWV復制水平，與蜜蜂吸收的營養物質有著密切關系。花粉含有蛋白質、糖類、脂類、維生素和礦物質等，是蜜蜂重要的營養物質來源。最初有研究發現，花粉與糖水相比，前者能激活健康蜜蜂相關的營養代謝途徑，如卵黃蛋白原(Vg)基因的表達，進而能對蜜蜂壽命產生積極影響，但是狄斯瓦螨的寄生行為抑制了蜜蜂的相關代謝途徑，即使攝入花粉也不能逆轉這種影響，并且花粉的攝入有利于DWV在蜜蜂體內的繁殖(Alauxetal., 2011)。

然而，另外的實驗證明，對于正常的蜜蜂，花粉和糖水喂食，兩者對蜜蜂壽命影響差異不大，但當蜜蜂被狄斯瓦螨寄生時，花粉能明顯提高蜂群存活率，并且喂食花粉的蜜蜂比喂食糖水的蜜蜂，具有更低的DWV水平，并且對微孢子蟲的耐受性上升，這可能與花粉中的非極性物質，如脂類有關，反映了花粉可能有助于減少蜂群損失(Annosciaetal., 2017; Tritschleretal., 2017)。

值得注意的是，蜜蜂消化花粉的能力有限，過量取食花粉反而對蜜蜂造成危害。只有攝入的蛋白質被蜜蜂有效地吸收，才能維持蜜蜂血淋巴中的蛋白質正常水平，進而促進蜜蜂的健康以及提高蜜蜂對病原的耐受性(Basualdoetal., 2014;Paolietal.,2014)。蜜蜂的營養代謝與腸道細菌群有著密切關系，在有腸道細菌的存在下，即使不提供花粉，蜜蜂的營養代謝和免疫系統不會受到很大影響，但如果使用抗生素，破壞蜜蜂腸道中的細菌群，蜜蜂的壽命會顯著縮短(Lietal., 2019)。營養物質與病原和寄主的相互作用機制，仍需要進一步研究。

4 防治

DWV的流行與爆發會給蜜蜂養殖產業以及背后的農業經濟造成巨大損失，但目前還沒有針對DWV的特效藥物。為了減少DWV的傳播與危害，可以從以下兩個方面著手：一是切斷DWV的傳播途徑；二是應用RNAi技術來抑制蜂群中DWV的繁殖。

4.1 DWV傳播途徑的切斷

DWV寄生于蜜蜂，水平較低時以隱形感染的的方式，長期廣泛地存在于蜂群中，當遇到外界壓力的激活或者環境因子的協同作用，往往會快速繁殖，表現顯性癥狀，造成蜜蜂殘翅病的爆發和流行。其中，狄斯瓦螨作為DWV的傳播媒介，極大地影響了DWV的流行情況。

為了減少DWV的傳播機會，一方面，從源頭出發，保證潔凈的養蜂環境，定期對蜂具用品全面清潔消毒。對來源復雜和規模較大的蜂群采取分散隔離方式放置，減少交叉感染機會(張炫等, 2012)。另一方面，要積極采取防治狄斯瓦螨措施，減少DWV的媒介傳播途徑。由于雄蜂房的巢房大小、封蓋時間以及繁殖環境的優勢，雄蜂房的狄斯瓦螨感染率是工蜂房的8～10倍(張祎和韓日疇, 2012)，因此割除雄蜂房可以大大減少狄斯瓦螨的數量(Wantuch and Tarpy, 2009)，但在實際操作中，比較費時費力；殺螨劑可有效防治狄斯瓦螨，針對狄斯瓦螨的不同分子靶點，最主要有神經靶點和肌肉靶點(Sparks and Nauen, 2015)，可使用蠅毒磷、聯苯菊酯、擬除蟲菊酯、雙甲脒、精油、硫丹等殺螨劑，然而大量反復使用殺螨劑，不僅導致了狄斯瓦螨的抗藥性不斷上升，還會危害蜜蜂健康以及產生蜂產品農藥殘留問題(Hillieretal., 2013; Sabováetal., 2019)；生防菌包括真菌與細菌對狄斯瓦螨均有一定毒力(Hamiduzzamanetal., 2012; Alquisira-Ramírezetal., 2017)，但還沒有廣泛應用，表現出明顯經濟效益；從寄主的角度出發，培育抗螨的蜜蜂品種，這種途徑雖然不容易實現但潛力無限。直接通過人工授精的方式，蜜蜂可能無法表現出抑制螨繁殖的性狀(Beaurepaireetal., 2019)。通過分子遺傳學手段，增強蜜蜂梳毛行為、螨敏感衛生行為等數量性位點基因的表達，可以培育出抗狄斯瓦螨的蜜蜂品種(Zakaretal., 2014)。目前已有抗螨的蜜蜂品種，如俄羅斯蜜蜂品種(Russia Honey Bee，RHB)，成功面向市場(Kirraneetal., 2018)。

4.2 RNAi技術的應用

目前生物技術RNA干擾(RNA interference, RNAi)在防治DWV方面取得新的進展。RNAi指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)誘發的同源mRNA高效特異性降解的現象，主要有3種途徑：microRNA(miRNA)途徑、piwiRNA(piRNA)途徑和small interfering RNA(siRNA)途徑。在害蟲防治中應用是siRNA途徑(Jogaetal., 2016)，其原理是將外源的dsRNA導入到害蟲體內，從而激活“siRNA途徑”，Dicer酶將dsRNA切割為24～31 nt左右的小分子RNA，引起同源mRNA特異性降解，沉默重要的基因，最終達到防治害蟲的目的。

早期研究用注射法傳遞dsRNA到狄斯瓦螨身上，表現出高達97%的RNAi效率 (Campbelletal., 2010)，然而注射法卻不適用于大規模的防治。用含有dsRNA的蔗糖溶液喂養蜜蜂，在蜜蜂血淋巴中檢測到dsRNA的存在，狄斯瓦螨取食蜜蜂的血淋巴后，dsRNA從蜜蜂水平轉移到狄斯瓦螨，實現狄斯瓦螨的致死率在60%以上，且dsRNA不會對蜜蜂自身造成影響(Garbianetal., 2012)。dsRNA不僅可以轉移到蜜蜂不同的組織、不同發育階段，也可以通過蜂王轉移到后代且具有生物學活性(Maorietal., 2019)。

細菌也可作為dsRNA的表達載體，dsRNA經細菌表達，再純化后喂食蜜蜂，蜜蜂體內病毒的表達水平下降，幼蟲存活率上升，用細菌來大規模生產dsRNA，是一種新的抗病毒策略(Zhangetal., 2016)。

RNAi也被廣泛應用在揭示細胞色素P450單加氧酶(CYPs)、羧酸酯酶(CarEs)和谷胱甘肽S-轉移酶(GSTs)等基因在殺蟲劑解毒和抗性中的作用。螨類經殺螨劑處理后，相關解毒基因的mRNA轉錄水平升高，死亡率下降，通過RNAi處理，解毒基因表達顯著下降，導致螨的敏感性和死亡率顯著上升(Liaoetal., 2016; Shenetal., 2016)，RNAi將有利于減低螨的抗藥性以及減少用藥成本。

RNAi的效率不僅與dsRNA的長度和濃度有關，還與dsRNA的完整性有關(Milleretal., 2012)。通過納米顆粒或者脂質體將dsRNA包裹起來，再傳遞到昆蟲體內，能明顯提高RNAi效率，而這些物質在保護dsRNA完整性的同時，自身容易降解(Heetal., 2013; Taningetal., 2016)。RNAi的效率還取決于多方面因素，包括靶標基因的設計、靶標昆蟲的種類、齡期、取食行為以及免疫系統等。隨著對RNAi的深入研究，相信未來基于dsRNA的生物農藥也將得到應用與推廣，但RNAi對于非靶標生物也存在潛在風險，只有做好風險評估與預防，RNAi應用安全性才能得到保證，從而更好地實現目標生物防治。

5 展望

從近些年的研究來看，DWV的寄主范圍在不斷擴大，DWV變異體和重組熱點的出現也威脅著蜜蜂以及新寄主物種的健康與生存。DWV及其變異體的致病機理研究依然是關鍵，它們是如何影響蜜蜂的健康、繁殖力以及與狄斯瓦螨-蜜蜂的相互作用，有待新技術的開發和應用來深入研究。

目前尚無治療DWV的藥劑，而狄斯瓦螨對DWV的傳播起到至關重要的作用，所以防治狄斯瓦螨是防控DWV的關鍵。單一的防治手段，往往難以兩全生態效益以及經濟效益，RNAi技術的應用是防控蜜蜂病毒的很好補充，對資源昆蟲的保護和生態環境安全有著十分重要的意義。相信未來病蟲害的防治將是多種方式的結合，從而達到更加高效、安全的目的，未來的農業也將向環境友好型不斷邁進。