蚊蟲組學研究進展

吳 恙，周騰飛，賴澤鈿，謝李華，謝雨谷，劉培文，劉 通，楊文強，金彬彬，孔 翎，郭怡佳，趙宜潔，鄧潔琳，顧金保，陳曉光

(南方醫科大學公共衛生學院病原生物學系暨廣東省熱帶病防治研究重點實驗室，廣州 510515)

蚊是一類重要的醫學昆蟲，能吸血傳病，是多種疾病如登革熱、寨卡病毒病、瘧疾、流行性乙型腦炎等的傳播媒介，對人類的日常生活和生命健康危害極大。長期以來，由于蚊基因組中高度重復序列的存在，使得蚊蟲基因特別是非編碼序列的分子克隆和功能分析非常困難。近年來，隨著高通量測序和生物信息學技術的成熟和不斷革新，蚊蟲基因組學、轉錄組學、小RNA組學等也取得了快速發展。本文對蚊組學相關領域的研究進展綜述如下。

1 基因組學研究

蚊基因組的解析和比較基因組分析有助于探索蚊基因組的結構和功能。大多數蚊染色體數是2n=6，只有按蚊亞科夏蚊屬的Chagasiabathana染色體數2n=8 (Rao and Rai, 1987)。在常見的媒介蚊蟲中，按蚊屬Anopheles擁有X和Y染色體，這對性染色體的核型是不同的，被稱為異態性染色體(heteromorphic sex chromosomes)(Neafseyetal., 2015)；伊蚊屬Aedes、庫蚊屬Culex、阿蚊屬Armigeres擁有一對核型相同的性染色體，被稱為同態性染色體(homomorphic sex chromosomes)(McKee and Handel, 1993)。蚊染色體有大量的移位和顛換，其結構和組成是蚊生物學性狀差異的基礎(Breland, 1961; Rai, 1999; Toups and Hahn, 2010)。近年來，隨著第二代測序、第三代測序、HiC染色體構象捕獲、Bionano光學圖譜等生物技術的快速發展和日益成熟，目前已公開發表了22種蚊的基因組，其中包括19種按蚊屬、2種伊蚊屬和1種庫蚊屬。

1.1 蚊基因組組成

蚊基因組具有明顯的多樣性，表現在相對高比例的單拷貝、中等重復和高度重復的序列，導致蚊種間基因組大小有大約8倍的變異。按蚊約為0.24～0.29 pg，巨蚊屬Toxorhynchites和煞蚊屬Sabethes基因組為中等大小(0.62 pg)，而庫蚊屬0.54～1.02 pg，脈毛蚊屬Culiseta為0.92～1.25 pg，騷擾阿蚊Armigeressubalbatus和Heamagogusequinius分別為1.24 pg和1.12 pg；作為全世界廣泛分布的伊蚊，其核DNA量變化超過3倍；波利尼西亞的兩種伊蚊基因組最小，僅0.59 pg；Ochlerotatuszoosophus則具有最大的基因組(1.9 pg)(Besansky and Collins, 1992; Severson and Behura, 2012; Bonizzonietal., 2013)。一般來說，在進化關系中，基因組大小隨著蚊科進化而增加。

在按蚊亞科，大約60%～80%的基因組是單拷貝序列(Neafseyetal., 2015)，而庫蚊亞科大多數是中等和高度的重復序列(Neneetal., 2007; Arensburgeretal., 2010; Chenetal., 2015; Matthewsetal., 2018)。蚊基因組組成的基本形式是短周期性散點式(short-period interspersion)，單拷貝序列長度為1 000～2 000 bp，交替出現短的(200～600 bp)和中等長度(1 000～4 000 bp)的重復序列，這在庫蚊亞科中是普遍現象(Neneetal., 2007; Arensburgeretal., 2010; Chenetal., 2015; Matthewsetal., 2018)；另一種形式是長周期性散點式(long-period interspersion)，長的(≥5 600 bp)和極長的(≥13 000 bp)重復交替不間斷地出現，這在按蚊亞科中是普遍現象(Neafseyetal., 2015)。

按蚊亞科和庫蚊亞科基因組組成的差別對于應用多線染色體物理作圖以及應用核糖體分子標志進行分類有重要的影響。在已經研究多線染色體的蚊屬中，僅按蚊屬具有染色中心(chromocenter)，而伊蚊屬、庫蚊屬、曼蚊屬、巨蚊屬、直腳蚊屬Orthopodomyia及懷蚊屬Wyeomyia缺少明顯的染色中心(Munstermannetal., 1985; Coluzzietal., 2002; Camposetal., 2003a; Camposetal., 2003b)。按蚊亞科容易制備高質量的多線染色體，被用于蟲種鑒定和物理作圖(Coluzzietal., 2002)。庫蚊亞科的多線染色體不易展開，可能與其基因組大量的重復序列易發生錯配有關，可用分裂中期的染色體進行研究(Camposetal., 2003a)。此外，在按蚊中，用轉錄間隔區(internal transcribed spacer, ITS)進行蚊種鑒定能獲得較為穩定的結果(Paskewitzetal., 1994)，而在庫蚊和伊蚊，由于存在較多的重復序列，用該標志進行蟲種鑒定，不易獲得重復穩定的結果(Porter and Collins, 1991)。

1.2 蚊基因組測序

1.2.1蚊基因組

岡比按蚊An.gambiaePEST(Pink Eye STandard)基因組于2002年首次公布(Holtetal., 2002)，是9株野生株系經人工雜交產生的實驗室品系，具有特征性的粉色眼，但該株系已于2005年遺失(Sharakhovaetal., 2007)。通過構建該株系的細菌人工染色體(bacterial artificial chromosome, BAC)并進行測序，以及近年來眾多研究者對其基因組不斷完善組裝，目前岡比按蚊PEST株基因組版本號為AgamP4，基因組大小約為273 Mb，Scaffold N50為49.4 Mb，包括8個scaffolds，分別為X染色體、2號染色體L臂、2號染色體R臂、3號染色體L臂、3號染色體R臂、Y染色體(未確定序列具體位置)、線粒體基因組和未知位置的序列(Holtetal., 2002; Sharakhovaetal., 2007)。

埃及伊蚊Ae.aegyptiLVP_AGWG(LiverpoolAedesGenome Working Group)株雄性基因組于2017年公布(Matthewsetal., 2018)，主要結合使用了PacBio第三代測序、HiC染色體構象捕獲和Bionano光學圖譜等生物技術，基因組版本號為AaegL5，大小約為1.278 Gb，Scaffold N50為409.8 Mb，包括2310個scaffolds，其中最長的 3個 scaffolds分別為1號、2號和3號染色體。該版本的基因組組裝首次報道了埃及伊蚊1號染色體中的雄性決定區域(M-locus)，這段區域富含重復序列而少有編碼基因，功能和結構類似于Y染色體，與埃及伊蚊雄性性別決定密切相關。

白紋伊蚊Ae.albopictus又名亞洲虎蚊，是一種最常見的入侵物種和媒介蚊蟲之一，并在全球有蔓延擴散的風險和趨勢，是寨卡病毒(Zika virus)、登革病毒(Dengue virus)、基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)等病原的傳播媒介(Bonizzonietal., 2013)。白紋伊蚊佛山株(Foshan)是我國學者于1981年開始近交培育的實驗室品系，其基因組巨大，變異度高于0.5%，且重復序列非常多。為了攻克這些基因組研究中的技術難題，我國學者通過純化基因組背景，結合全基因組擴增(whole genome amplification, WGA)，并構建了不同插入長度的測序文庫進行了大量測序，于2015年首次公布了白紋伊蚊佛山株基因組，版本號為AaloF1，基因組大小約為1.923 Gb，包括154 782個 scaffolds (Chenetal., 2015)。

已發布的幾種常見媒介蚊蟲基因組基本數據歸納于表1中。

表1 常見媒介蚊蟲基因組的基本數據Table 1 The basic information on the genome of major vector mosquitoes

不同蚊種的基因組大小差異巨大，這是由于重復序列是蚊蟲基因組的主要構成，而且其所占比例與基因組大小呈正相關，比如岡比按蚊基因組中重復序列比例約為14%(Neafseyetal., 2015)，致倦庫蚊Cx.quinquefasciatus重復序列比例約為29%(Arensburgeretal., 2010)，埃及伊蚊重復序列比例約為65%(Matthewsetal., 2018)，白紋伊蚊基因組中重復序列比例約為68%(Chenetal., 2015)。這些基因組中大量的重復序列主要包括多基因家族(multigene family)、微衛星(microsatellite)、小衛星(minisatellite)、核糖體DNA(ribosomal DNA, rDNA)和轉座子(transposable element, TE)。

(1)微衛星：是指基因組中由短的重復單元(一般為1～6個堿基)組成的DNA串聯重復序列，位于著絲粒和端粒區，反映位點特異性，具有高度多態性，在按蚊亞科中是很好的遺傳標志(Fieldetal., 1999)，但在庫蚊亞科中的應用有限(Bahnck and Fonseca, 2006)。

(2)核糖體DNA：rDNA由外轉錄間隔區(external transcribed spacer, ETS)、18S RNA基因、內轉錄間隔區1(internal transcribed spacer, ITS1)、5.8S RNA基因、ITS2、28S RNA基因，以及基因間非轉錄間隔區(intergenic nontranscribed spacer, IGS)組成。ITS和IGS具有明顯的種間和種內多態性，是重要的分類鑒定標志(Waltonetal., 1999)。大多數庫蚊屬rDNA位于1號染色體；伊蚊、吸蚊屬位于2號染色體(Timoshevskiyetal., 2012)；阿蚊屬和竹生杵蚊Tripteroidesbambusa位于3號染色體(Kumar and RAI, 1990)；大多數按蚊屬rDNA位于X染色體，四環按蚊An.quadriannulatus、米拉按蚊An.melas、純凈按蚊An.merus、四斑按蚊An.quadrimaculata位于X和Y染色體(Collins and Paskewitz, 1996)；而三列騷擾蚊OchlerotatustriseriatusrDNA位于1號和3號染色體上(Grahametal., 2004)。

(3)轉座子(TE)：是中等重復DNA序列，具有能夠在基因組中移動并自身復制的功能。共有兩種類型：一類是反轉座子(retrotransposons)，通過RNA介導的反向轉錄而實現轉座；另一類直接從DNA到DNA實現轉座。在多種蚊基因組中已經鑒定了大量的轉座子，相關具體內容可以搜索并查詢TEfam數據庫網站(https://tefam.biochem.vt.edu)(Diaoetal., 2011)。

1.2.2比較基因組

通過比較蚊與果蠅或不同蚊種之間基因組組成結構，有助于發現物種特有的基因、研究蚊蟲性別決定機制、鑒定殺蟲劑抗性突變位點、分析不同蚊蟲傳播疾病的能力(即媒介能量)及了解蚊發育生物學和系統進化關系。

岡比按蚊、致倦庫蚊、埃及伊蚊和白紋伊蚊分別屬于兩類不同蚊亞科，它們所攜帶傳播的病原種類和媒介能量均有顯著差異，生活習性也不盡相同。比較基因組學分析將有助于了解蚊蟲在這些生物學特性方面的區別、理解蚊媒病原體感染機制，這對尋找阻斷疾病傳播的途徑大有裨益。例如，不同蚊種對血液的不同偏好，在選擇宿主時的行為差異，傳播特定病原體時的個體能力差別，有些蚊在清晨、傍晚吸食人血，有些蚊多在夜間活動等。比較埃及伊蚊與岡比按蚊的基因組有諸多相似之處，但在基因組整體規模、基因密度及基因家族的構成等方面有所差別。其中，岡比按蚊的氣味結合蛋白、細胞色素P450以及表皮相關的基因數量和種類多于埃及伊蚊，從基因組水平上顯示了這兩種蚊的生物學性狀差別(Seversonetal., 2004; Manoharanetal., 2013)。

致倦庫蚊基因組中約有18 965個編碼蛋白基因，比埃及伊蚊多29%，比岡比按蚊多45%。與兩種蚊相比，致倦庫蚊的基因家族數量明顯較多，包括與嗅覺和味覺受體、唾液腺和免疫系統功能等有關的基因。此外，致倦庫蚊與免疫反應相關的基因大約有500個，與伊蚊相似，但明顯少于岡比按蚊和黑腹果蠅(Arensburgeretal., 2010)。致倦庫蚊是多種腦炎病毒及淋巴絲蟲的媒介，其復雜的基因結構有可能提高了其向人類和鳥類傳播病毒的能力；也有些基因可能與對不利或外來有害物的適應性有關，因為庫蚊的孳生地常常是污染嚴重的環境(Reddyetal., 2012)。

通過提取和比對不同蚊的上千個單拷貝同源基因并擬合模型、構建系統進化關系，發現埃及伊蚊與白紋伊蚊大約在7 140萬年前分化，伊蚊屬與庫蚊屬大約在1.79億年前分化，按蚊亞科與庫蚊亞科大約在2.18億年前分化，蚊科的共同祖先與同屬于雙翅目的果蠅大約在2.61億年前分化(Chenetal., 2015)，見圖1。

圖1 主要的媒介蚊蟲與黑腹果蠅的系統進化圖Fig.1 The phylogeny tree of major vector mosquitoes and Drosophila melanogaster

通過比較雌、雄基因組Illumina測序數據，有學者發明了染色體商(chromosome quotient, CQ)的方法，篩選并鑒定了埃及伊蚊的性別決定基因Nix(Halletal., 2015)和斯氏按蚊An.stephensiY染色體基因Guy1(Criscioneetal., 2013; Criscioneetal., 2016)。國內有學者使用類似的方法在白紋伊蚊中鑒定出雄性特異性基因Nix(埃及伊蚊Nix基因的直系同源基因)(Liuetal., 2020)。研究表明，如果從雄性個體中敲除雄性特異性基因，會導致雄性個體出現雌性化的性狀(Halletal., 2015; Liuetal., 2020)；如果將這些雄性決定相關的基因轉入雌性個體，會導致雌性個體表現雄性化性狀，或出現特異性、穩定性的死亡(Aryanetal., 2019; Qietal., 2019)。這類研究為防控蚊媒疾病提供了新的思路(Adelman and Tu, 2016)。

近年來，隨著化學殺蟲劑的大量使用，蚊蟲對各類化學殺蟲劑的抗性也被廣泛報道。通過比較對不同種類化學殺蟲劑產生抗性的蚊蟲基因組和敏感的蚊蟲基因組發現，按蚊屬和庫蚊屬基因組中編碼乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase, AChE)的基因第119位密碼子由甘氨酸突變為絲氨酸(G119S)，與蚊蟲對有機磷酸酯類(organophosphate)和氨基甲酸酯類(carbamate)殺蟲劑產生抗性相關(Djogbénouetal., 2010; Camerinoetal., 2015; Tmimietal., 2018)；伊蚊屬基因組中編碼電壓門鈉離子通道蛋白(voltage-gated sodium channel, VGSC)的基因第1534位密碼子由苯丙氨酸突變為半胱氨酸(F1534C)，與蚊蟲對擬除蟲菊酯類(pyrethroid)殺蟲劑產生抗性相關(Chenetal., 2016; Xuetal., 2016)。如果同時存在第1 016位密碼子由纈氨酸突變為異亮氨酸(V1016I)或甘氨酸(V1016G)，則與蚊蟲對殺蟲劑DDT產生抗性相關(Alvarezetal., 2015; Sombiéetal., 2019)。

2 蚊蟲轉錄組學研究

轉錄組學(transcriptomics)是一種生理狀態下細胞所能轉錄出來的所有mRNA的總和，是研究特定生理狀態下機體表型和功能的重要手段。傳統上用于轉錄組數據獲得和分析的方法主要有基于雜交技術的芯片技術，包括cDNA芯片和寡聚核苷酸芯片，但目前使用最普遍的是轉錄組測序技術(RNA-seq)。基于Illumina高通量測序平臺的轉錄組測序技術能夠在單核苷酸水平對任意物種的整體轉錄活性進行檢測，在分析轉錄本的結構和表達水平的同時，還能發現未知轉錄本和低豐度轉錄本，精確地識別可變剪切位點以及cSNP(編碼序列單核苷酸多態性)，提供最全面的轉錄組信息。

斯氏按蚊雄性個體具有X和Y染色體，雌性個體具有一對X染色體，因此雄性的X染色體基因只有一份拷貝，雌性的X染色體基因有兩份拷貝，但雌性X染色體基因和雄性X染色體基因的表達水平是相同的，這種現象被稱為劑量補償效應(dosage compensation)(Jiangetal., 2015)。斯氏按蚊X染色體上有上千個編碼基因，利用高通量的轉錄組測序的方法可以高效、快速、精確地計算每個編碼基因的相對表達水平，有研究發現在親本斯氏按蚊常染色體中轉入并表達Y染色體基因Guy1會導致雌性子代全部死亡，通過比較雄性子代和雌性子代轉錄組數據，證明了Y染色體基因Guy1是直接啟動劑量補償效應的信號，異常表達Guy1基因使雌性X染色體基因表達水平被錯誤上調是導致雌性子代全部死亡的主要原因(Qietal., 2019)。

另外，轉錄組學分析還常用于蚊蟲不同發育階段、不同器官和不同性別的差異表達基因研究，例如：有研究通過比較和分析白紋伊蚊在卵(egg)、幼蟲(larva)、蛹(pupa)、雄性成蚊和吸血前后雌性成蚊、感染登革病毒前后等不同生理狀態的轉錄組數據，篩選得到了與胚胎發育相關基因、與雌性成蚊吸血相關基因、蚊蟲感染登革病毒后免疫相關基因等(Poelchauetal., 2013; Grigorakietal., 2015; Esquiveletal., 2016)；還有研究通過比較埃及伊蚊的頭(head)、觸角(antenna)、觸須(palp)、吻突(proboscis)、喙(rostrum)、腿(leg)、腹節(abdomere)和卵巢(ovary)等器官組織的轉錄組數據，可以得到多種基因的空間表達譜，包括編碼氣味分子受體(odorant receptor)、親離子型受體(ionotropic receptor, IR)和味覺受體(gustatory receptor, GR)的基因，這些基因被認為與蚊蟲搜尋宿主密切相關(Priceetal., 2011; Alfonso-Parraetal., 2016; Matthewsetal., 2016)。

轉錄組學的技術手段是深入研究蚊蟲的分子生物學相關領域的強大工具，提供了精確的數字化信號、高效的檢測通量和廣泛的檢測范圍，適用于綜合測量和計算蚊蟲基因相對表達水平，有助于研究者了解蚊蟲在不同生理狀態下的整體轉錄活動。

3 蚊蟲小RNA組學研究

小RNA(small RNAs)主要指長度在18～30 nt的一類非編碼RNA(ncRNA)。在真核生物中，具有基因表達調控功能的小RNA主要有微小RNA(microRNA, miRNA)、內源小干擾RNA(endo-siRNAs)和piwi干擾RNA(piRNA)。miRNA和endo-siRNA長度主要集中在20～24 nt，piRNA長度集中在26～31 nt。miRNA在動植物和微生物中都普遍存在，據估計一個物種中約1/3的基因會受到miRNA的調控，大量的實驗也表明miRNA參與了諸多生命過程的調控，例如細胞周期、細胞分化、組織器官的發生、營養代謝、信號途徑以及對外界生物的、非生物環境的反應。piRNA目前主要在動物的生殖系干細胞、果蠅的卵巢體細胞中被發現(Klattenhoff and Theurkauf, 2008; Lauetal., 2009)，其主要功能是參與轉座子的沉默。以往用于尋找小RNA的方法主要有實驗克隆法和計算機預測法。實驗克隆法可以直接用于鑒定新的小RNA，是初期發掘小RNA的常用方法，不足之處是實驗周期較長，對低表達的小RNA的發現能力十分有限；計算機預測法多是針對某一已知的小RNA特征設計算法，從全基因組或EST數據庫中快速發掘大量潛在的小RNA，一定程度上彌補了克隆法的缺點，然而，預測的小RNA最終還需要實驗證明，而且計算機預測法對新類型小RNA的發掘能力十分有限。隨著第二代高通量測序技術的問世，小RNA測序(small RNA-Seq)技術開始逐漸取代原始的小RNA發掘法，該技術具有速度快、成本低、覆蓋度深等多方面的優點，對鑒定與發現生命體內的小分子RNA及其功能與機理研究具有重要作用。

目前為止，僅岡比按蚊、斯氏按蚊、埃及伊蚊、致倦庫蚊和白紋伊蚊有miRNA的鑒定報道(Winteretal., 2007; Mead and Tu, 2008; Lietal., 2009; Thirugnanasambanthametal., 2013; Biryukovaetal., 2014; Liuetal., 2015)。miRNA功能分析表明，miRNA對蚊蟲的卵巢發育和吸血后的血液消化具有調節作用(Bryantetal., 2010; Lucasetal., 2015)。另外，病毒感染可以對宿主細胞miRNA的表達水平產生巨大影響，這可能與宿主抗病毒機制及病毒入侵后改變細胞內環境有關，雌蚊中miRNA的表達模式會隨著病原體的感染而發生變化(Hussainetal., 2013; Zhouetal., 2014b)。國外有學者對登革病毒(DENV)編碼的miRNA或病毒小RNA(vsRNA)的進行了功能研究，他們發現6個vsRNA能通過作用于病毒基因組RNA莖環結構中的5′和3′ UTR區，顯著增加病毒復制(Hussain and Asgari, 2014)。中腸屏障是蚊蟲防止病原體入侵的一道重要屏障，有研究發現miR-1174僅在伊蚊和按蚊的中腸中表達，且雌蚊吸血后其表達量明顯上調；而當miR-1174表達下調后，蚊蟲吸血率明顯降低，壽命明顯縮短(Liuetal., 2014)。

國內有研究對白紋伊蚊不同發育時期(卵、幼蟲、蛹、雄蚊、雌蚊、吸血后雌蚊)的小RNA進行了深度測序分析。結果在白紋伊蚊中篩選出119條已知的miRNA基因，確定了15條新的miRNA基因，其中11條是白紋伊蚊特異的，并且許多miRNA僅在特定的發育時期表達：經過實驗驗證，miR-286、miR-2492和miR-1891分別在白紋伊蚊的卵、幼蟲和成蟲期特異高效表達，敲低或敲除這些miRNA會對蚊蟲的生長發育造成顯著影響(Guetal., 2013; Liuetal., 2015)。這些研究為新型生物殺蟲劑的研發提供了靶標。另外還有研究對感染登革病毒前后白紋伊蚊的細胞和成蟲的小RNA進行了深度測序分析，結果在感染登革病毒的白紋伊蚊中找到了10條表達上調的miRNA和11條表達下調的miRNA(Skalskyetal., 2010)。通過對這些差顯表達miRNA的功能分析發現，miR-252通過與E蛋白3′ UTR區域的結合，對登革病毒的復制起到抑制作用(Yanetal., 2014)；而miR-281則通過與E蛋白5′ UTR區域的結合，對登革病毒的復制具有促進作用。這些研究為抗登革病毒藥物的設計和研發提供了線索和方向(Zhouetal., 2014b)。

piRNA來源于轉座子、基因間隔區和一些編碼蛋白質基因的3′ UTR區，對維持基因的完整性和穩定性有一定作用，最近還有研究證明piRNA在抗病毒免疫中也有較大作用：對蚊蟲細胞感染蟲媒病毒可以引發piRNA通路，而敲除piRNA基因會使病毒滴度增加(Lucasetal., 2013; Schnettleretal., 2013)。多個24～30 nt與piwi相互作用的RNA基因組簇可以比對到轉座子和蛋白質編碼基因的3′ UTR區，很多轉座子和一些內源性基因的3′ UTR區會產生大量具有piRNA樣特征、長度為29 nt的小RNA峰(Castellanoetal., 2015)。另有研究通過對比缺失dicer-2基因的蚊細胞系和野生型蚊細胞系發現，病毒產生的piRNA樣小RNA可以在病毒產生siRNA的過程中調節病毒感染的發生，這可能是一種蚊蟲抗病毒感染的途徑(Morazzanietal., 2012)。