高校液相色譜對3,5-二硝基鄰甲基苯甲酸含量的測定

陳海燕　張文鴻　朱正虎　石飛

摘 要：本文通過改變高效液相色譜的流動相研究對3，5-二硝基鄰甲基苯甲酸的出峰峰形的影響。從而說明流動相對檢測結果的重要性。

關鍵詞：高效液相色譜;流動相;峰形

3，5-二硝基鄰甲基苯甲酸是二硝托胺（球痢靈）中間體，二硝托胺（球痢靈）化學名為3，5-二硝基鄰甲基苯甲酰胺。二硝托胺（球痢靈）結構式見圖1。

二硝托胺常作為抗球蟲藥，用于雞球蟲病。在飼料行業中成為搶手貨，頗受國內外用戶的青睞。需求量比較大。對產品的質量要求越來越高。中間體的質量決定了產品的質量和效益。因此對3，5-二硝基鄰甲基苯甲酸進行分析。其結構式見圖2。

原來二硝托胺中間體的檢測方法是測其熔點，該物質為淺黃色粉末，熔點：198℃-205.0℃。熔點儀測試該物質有一定的局限性。因現在的儀器越來越先進，越來越精密，對于該物質完全可以用科學有效的分析方法來測定。高效液相色譜法（HPLC）來鑒別和分析該物質是有效可靠的方法。HPLC的優點：速度快，分辨率高，靈敏度高，柱子可反復使用，使用樣品量少。不同的物質需要不同性質的柱子和相應流動相的配比。高效液相色譜法是目前及其常見的分析方法。在高效液相色譜法中，測定法有4種：內標法、外標法、主成分自身對照法、面積歸一化法。有關物質檢測常用外標法、主成分自身對照法、面積歸一化法，其中主成分自身對照法又分為加校正因子主成分自身對照法，不加校正因子主成分自身對照法。本文主要討論面積歸一化法。

1 高效液相色譜

高效液相色譜目前在檢測工作中廣泛使用，對檢驗進行質量控制是保證結果可靠、準確的基本要求。在高效液相檢測過程中，通過綜合使用系統適用性、空白分析、質控樣品、重復分析、室內質量控制、不確定度評定等質控手段，根據實驗室實際條件和風險評估原則選擇適當的質控手段，從而保證高效液相檢測過程中的質量，保證便捷、準確、穩定的高效液相檢測結果。高效液相色譜法一要了解其分離的基本原理，二要了解其的基本構造，三要了解其的基本操作。

在高效液相測試中流動相要求和配比在高效液相色譜操作過程中起關鍵作用。流動相的性質要求：一個理想的液相色譜流動相應具有低粘度、與檢測器兼容性好、易于得到純品和低毒性等特征。

流動相選擇：①由強到弱：一般先用90%的乙腈（或甲醇）/水（或緩沖溶液）進行試驗，這樣可以很快地得到分離結果，然后根據出峰情況調整有機溶劑（乙腈或甲醇）的比例;②三倍規則：每減少10%的有機溶劑（甲醇或乙腈）的量，保留因子約增加3倍，此為三倍規則。這是一個聰明而又省力的辦法。調整的過程中，注意觀察各個峰的分離情況;③粗調轉微調：當分離達到一定程度，應將有機溶劑10%的改變量調整為5%，并據此規則逐漸降低調整率，直至各組分的分離情況不再改變。

流動相的脫氣：HPLC所用流動相必須預先脫氣，否則容易在系統內逸出氣泡，影響泵的工作。氣泡還會影響柱的分離效率，影響檢測器的靈敏度、基線穩定性，甚至使無法檢測。

流動相的濾過：所有溶劑使用前都必須經0.45μm（或0.22μm）濾過，以除去雜質微粒，色譜純試劑也不例外（除非在標簽上標明“已濾過”）。

流動相的貯存：流動相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內，不能貯存在塑料容器中。一般情況下，甲醇--水系統已能滿足多數樣品的分離要求，且流動相粘度小，價格低，是反相色譜最常用的流動相。乙腈--水系統，因為與甲醇相比，乙腈的溶劑強度較高且粘度較小，看起來乙腈--水系統要優于甲醇--水系統。但參考資料：乙腈的毒性是甲醇的5倍，是乙醇的25倍，價格是甲醇的6-7倍。擇優選擇溶劑是流動相的關鍵。流動相首選甲醇--水系統，應盡可能少用含有緩沖液的流動相。如為堿性流動相的pH值應為7～8，如為酸性流動相的pH值應為3～4。綜上所述，對3，5-二硝基鄰甲基苯甲酸的測定首選甲醇--水系統。

2 實驗驗證

2.1 儀器設備及試劑

檢測儀器：Waters2489檢測器，515泵。

色譜柱：Kromasil C184.6×150mm或同等柱子。

天平：Mettler AB135S或同等設備。

玻璃儀器：A級計量儀器或同等儀器。

水：二次蒸餾水。

甲醇：HPLC級。

樣品：3，5-二硝基鄰甲基苯甲酸。

2.2 實驗操作

條件1：流動相：甲醇：水=500：500;波長230nm。

樣品制備：稱取3，5-二硝基鄰甲基苯甲酸樣品100.9mg

于100mL容量瓶中，濃度：1.009mg/mL，用甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，再用移液管吸取5.0mL該溶液于100mL容量瓶中，用流動相（甲醇：水=500：500）稀釋至刻度。

色譜條件：波長：230nm;進樣量：20ul，流速：1.0mL/min;運行時間10min。

具體分析如圖3：

條件2：流動相：甲醇：水：稀磷酸=300：700：60;波長230nm。

樣品制備：稱取3，5-二硝基鄰甲基苯甲酸樣品100.9mg，于100mL容量瓶中，濃度：1.009mg/mL，用甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，再用移液管吸取5.0mL溶液，用流動相（甲醇：水：稀磷酸=300：700：60）稀釋至100mL。

色譜條件：波長：230nm;進樣量：20ul，流速：1.0mL/min;運行時間30min。

具體分析如圖4：

條件3：流動相：甲醇：水：稀磷酸=700：300：60;波長230nm。

配成700：300：60的甲醇：水：稀磷酸（0.17%）流動相，混合均勻，使用前用0.45um濾膜過濾，使用前脫氣。

樣品制備：稱取3，5-二硝基鄰甲基苯甲酸樣品99.9mg，

于100mL容量瓶中，濃度：0.999mg/mL，用甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，再用移液管吸取5.0mL溶液，用流動相（甲醇：水：稀磷酸=700：300：60）稀釋至100mL。

色譜條件：波長：230nm;進樣量：20ul，流速：1.0mL/min;運行時間15min。

具體分析如圖5：

3 結果討論

對比上述三張圖譜觀察發現流動相為甲醇：水=500： 500時，出峰時間很早，并且主峰不對稱，拖尾因子超過1.8，此方法不適用。當在流動相中加入稀磷酸配制成甲醇：水：稀磷酸=300：700：60時，出峰時間太晚。然后又通過調整流動相中各成分比例，配置成甲醇：水：稀磷酸=700：300：60時，出峰時間已經峰形都比較合適。

所以流動相的選擇對檢測樣品檢測結果起著很關鍵的作用，我們可以通過了解產品的性狀，進行流動相測試試驗選擇合適的流動相，對我們的產品檢測有著很好的效果體現。

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