熒光猝滅體系測定谷胱甘肽

唐瑞韓,劉 丹,張心悅

（四川文理學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院,四川 達(dá)州635000）

由谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸合成的還原型谷胱甘肽（Glutatione,GSH）主要用于保護(hù)肝臟,幫助肝臟排毒,抑制脂肪肝的形成,改善因感染或中毒導(dǎo)致的肝炎.［1］由此可見,在臨床上定性定量檢測GSH 有重要意義.目前GSH 的檢測主要有高效液相色譜法、［2］電化學(xué)分析法［3］等.熒光分光光度法［4］因為操作簡單、使用方便、費(fèi)用低而被廣泛應(yīng)用于離子測定及藥物檢測.7-（二乙基氨基）香豆素-3-甲酸有發(fā)光團(tuán),可發(fā)射藍(lán)色熒光,應(yīng)用于生物檢測.［5］具有內(nèi)濾效應(yīng)的MnO2納米薄片可猝滅熒光,建立turn-off 體系.本論文擬采用熒光分析法,首次利用MnO2納米薄片與7-（二乙基氨基）香豆素-3-甲酸構(gòu)造熒光信號turn-off 平臺,用于定量測定GSH,建立一種測定GSH 的新方法.

1 實(shí)驗儀器及方法

1.1 儀器和試劑

熒光分光光度計（日立F-2700）;高錳酸鉀（批號:CAS 號7722-64-7）和硫酸錳（批號:HG3-1081-77）;谷 胱 甘 肽（ 還 原 型 ）（ 批 號:G105426-1g）和7-（二乙基氨基）香豆素-3-甲酸（批號:D154333-1g）購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;不同pH 值的檸檬酸鈉－檸檬酸緩沖液（NaCA-CA）、NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液（PB）均為實(shí)驗室自制.所有試劑除特別說明外均為分析純,實(shí)驗用水均為蒸餾水.

1.2 方法

1.2.1 MnO2納米薄片的制備［6］

稱 取0.0632gKMnO4、0.1014gMnO2溶 解 于適量蒸餾水中,在離心機(jī)上離心10min,用95%乙醇和水分別洗滌5 次,置于65℃烘干箱4h,取出黑色MnO2納米薄片備用.在分析天平上稱取MnO2納米薄片0.0780g,用蒸餾水將其溶解并在50mL 容量瓶中定容.超聲處理得到分散物.

1.2.2 7-（二乙基氨基）香豆素-3-甲酸和MnO2熒光體系的建立

取0.5mL 1mmol/L 的7-（二乙基氨基）香豆素-3-甲酸和0.2mL 1.56mg/mL 的MnO2于比色管定容至5mL,充分混合,常溫靜置10min,從而建立7-（二乙基氨基）香豆素-3-甲酸-MnO2納米猝滅體系.設(shè)置λex=400nm 進(jìn)行測定,記錄熒光強(qiáng)度.

1.2.3 測定還原型谷胱甘肽

在上述體系中加入不同量的GSH,在50℃水浴中反應(yīng)40min,選取λex=400nm 作為激發(fā)波長進(jìn)行測定,記錄熒光變化量.

2 結(jié)果與討論

2.1 復(fù)合體系的熒光光譜圖

7-（二乙基氨基）香豆素-3-甲酸因具有特殊的熒光發(fā)光團(tuán),當(dāng)加入一定量的MnO2后熒光被猝滅,再加入一定量的GSH 后,熒光值逐漸增加,根據(jù)熒光信號的開關(guān)可用于定量檢測GSH,見圖1.向7-（二乙基氨基）香豆素-3-甲酸-MnO2復(fù)合體系加入不同量的GSH,實(shí)驗結(jié)果見圖2.由圖2 可知,GSH 的量在2-18nmol/mL 范圍內(nèi)與熒光恢復(fù)值具有良好的線性關(guān)系.

圖1 不同物質(zhì)的熒光光譜

a:7-（二乙基氨基）香豆素-3-甲酸

b:7-（二乙基氨基）香豆素-3-甲酸-MnO2復(fù)合體系

c:7-（二乙基氨基）香豆素-3-甲酸-MnO2復(fù)合體系-谷胱甘肽

圖2 GSH 的線性

2.2 最佳實(shí)驗條件

2.2.1 MnO2的優(yōu)化

取0.5ml40μg/mL 的香豆素,加入不同量的MnO2,實(shí)驗結(jié)果見圖3.從圖3 中可看出,增加MnO2濃度,7-（二乙基氨基）香豆素-3-甲酸的熒光值明顯降低.本實(shí)驗選取0.06mg/mL 時,達(dá)到最好的猝滅效果.

2.2.2 pH 的選擇

本實(shí)驗選擇了BR、NaCA-CA 和PB 等緩沖試劑進(jìn)行考察,測定其對GSH 檢測體系的影響,最終選擇PB 作為該體系的緩沖溶液,進(jìn)一步確定了最佳pH 為6.3,實(shí)驗結(jié)果如圖4.

圖3 MnO2猝滅香豆素的熒光優(yōu)化

圖4 反應(yīng)體系的緩沖優(yōu)化

2.2.3 最佳溫度和反應(yīng)時間

首先考察了最佳反應(yīng)時間,實(shí)驗結(jié)果表明該體系在40min 趨于穩(wěn)定,同時考察了檢測體系的溫度靈敏度,由實(shí)驗結(jié)果可知,本體系的最優(yōu)反應(yīng)溫度為50℃,最優(yōu)反應(yīng)時間為40min

圖5 反應(yīng)體系溫度和時間的優(yōu)化

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在最優(yōu)實(shí)驗條件下,加入的GSH 的濃度不一樣,該體系的熒光恢復(fù)值不同,據(jù)此繪制其標(biāo)準(zhǔn)曲線,實(shí)驗結(jié)果見表1.該體系線性方程為ΔF=236.5X+104.155,檢出限為0.606nmol/mL,線性范圍為2～18nmol/mL.

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 方法的選擇性和特異性

經(jīng)實(shí)驗考察,金屬離子對該體系不會造成影響,多巴胺、抗壞血酸和其他氨基酸除半胱氨酸外,不會造成熒光恢復(fù).

圖6 金屬離子和生物分子對該體系的響應(yīng)

3 實(shí)際應(yīng)用

將該方法運(yùn)用于還原性GSH 片劑中GSH的測定,結(jié)果見表2,由實(shí)驗結(jié)果可以得出該方法運(yùn)用于GSH 片劑中的GSH 的測定,回收率在99.3%～100.5%,能較好地測定片劑中的GSH 含量.

表2 GSH片劑的分析

結(jié) 論

本論文構(gòu)建了7-（二乙基氨基）香豆素-3-甲酸產(chǎn)生熒光,MnO2加入后使得熒光發(fā)生猝滅的熒光信號turn-off 的復(fù)合體系,繼續(xù)加入一定量的GSH,熒光強(qiáng)度將恢復(fù),建立了熒光信號開關(guān)型檢測體系,用于檢測實(shí)際樣品的谷胱甘肽的含量,效果較好.該方法靈敏度高,方便快捷.