野生蒙古口蘑多糖通過STAT3 和HIF-1α 通路對LPS 誘導的巨噬細胞發揮抗炎調節作用

于傳宗， 張鳳蘭， 慕宗杰， 李子欽， 孫峰成， 郝麗珍*

（1 內蒙古農業大學 園藝與植物保護學院，內蒙古 呼和浩特010018；2. 內蒙古自治區農牧業科學院，內蒙古 呼和浩特010031）

炎癥是人體為保護自身免受外來環境侵害的防御系統[1]。 在炎癥過程中，巨噬細胞通過釋放前列腺素和促炎性細胞因子 （TNF-α、IL-6、IL-1α 和IL-1β）等，對有害物刺激物（如食物、病原體、藥物）的侵擾做出反應，這一過程稱為吞噬作用[2]。 在這個過程中，吞噬細胞會產生具有毒性的副產物，包括活性氧如一氧化氮（NO）、過氧化氫（H2O2）、超氧陰離子（O2-），雖然這些炎癥介質在機體防御機制中是必不可少的，但是過量的活性氧會對細胞的氧化應激產生壓力， 引起的慢性炎癥會持續地破壞組織。炎癥已經被證明與各種疾病的發病機制有關，如糖尿病[3]、老年癡呆癥[4]、心血管疾病[5]和癌癥[6]。 已經有很多抗炎癥的藥物被開發并在臨床獲得應用，控制和回復異常的炎癥。 目前主要的有2 類抗炎藥，最主要且用量最大的非甾體類抗炎藥， 如阿司匹林、對乙酰氨基酚、吲哚美辛、萘普生、雙氯芬酸、布洛芬、尼美舒利、羅非昔布、塞來昔布等；甾體類抗炎藥，如潑尼松、地塞米松等。 這些抗炎藥的使用已被證明會誘發死亡[7]，也有研究表明非甾體類抗炎藥的使用會引起肝損傷[8]。 尋找更有效安全的抗炎藥，是研究的一個熱點。 蒙古口蘑多糖提取物已經被證明具有抗炎癥、抗氧化的作用[9]，然而其作用機制和作用途徑仍然不清楚。 細菌內毒素（LPS）通過Toll樣受體4 （toll-like receptor 4, TLR 4） 激活巨噬細胞，是慢性炎癥巨噬細胞（RAW 264.5）的強效刺激物之一[10]，作者通過LPS 誘導RAW264.7 細胞，選取炎癥與氧化應答相關的基因Hypoxia-induciblefactor1α （HIF-1α）、Nuclear factor-κB（NF-κB）、Signal transducer and activator of transcription3protein（STAT3）、Cyclooxygenase -2 （COX -2） 和Inducible nitric oxide synthase（iNOS）檢測蒙古口蘑多糖影響細胞炎癥反應，發揮抗炎作用的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

Cell Counting Kit： 購自日本同仁化學-東仁化學科技 （上海） 有限公司；LPS，S-Methylisothiourea Sulfate（SMT）：購自Sigma-aldrich 公司；細胞RNA提取試劑盒： 購自北京天根生化科技有限公司；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit，Maxima SYBR Green qPCR Master Mix： 購自Thermo Fisher公司；RPMI 1640 培養基： 購自BI 公司； 胎牛血清FBS：購自北京四季青生物科技有限責任公司；Anti-COX2 antibody： 購 自Abcam 公 司；HIF1α Rabbit Polyclonal antibody，NF-κB Rabbit Polyclonal antibody，STAT3 Rabbit Polyclonal antibody： 購自Proteintech公 司 ；Anti -GAPDH Monoclonal Antibody，HRP affinipure Goat Anti-Rabbit igG（H+L），HRP affinipure Goat Anti-Mouse igG（H+L）：購自Earthox 公司；超敏ECL 化學發光試劑盒：購自上海碧云天生物技術有限公司；Mouse IL-1β ELISA kit （小鼠白細胞介素-1β），Mouse TNF-α ELISA kit （小鼠腫瘤壞死因子-α）：購自欣博盛生物科技有限公司；引物：由上海生工生物工程股份有限公司合成。

ND-1000 型微量紫外分光光度計、 凍干機、普通PCR 儀：購自Thermo Fisher 公司；5430R 低溫臺式冷凍離心機：購自Eppendorf 公司；BG-power5000型穩壓穩流電泳儀：購自北京百晶生物技術有限公司；實時定量PCR 儀：購自Bio-rad 公司；凝膠成像系統：購自GE Healthcare 公司等。

1.2 實驗對象

蒙古口蘑采摘于內蒙古錫林郭勒草原， 切片，在（-50±3） ℃，凍干48 h，自動勻漿機勻漿后，取粉末100 g 加入體積分數80% 1 L 的乙醇， 室溫3 d，上清液即為質量濃度100 g/L 的多糖提取物（Tricholoma mongolicum polysaccharide extract，TMPE）[11]。 小鼠巨噬細胞（RAW264.7），培養條件：1640 培養基、10% FBS、37 ℃、體積分數5% CO2。

1.3 試驗方法

1.3.1 細胞活力實驗取對數期RAW264.7 細胞懸液接種于96 孔板，接種密度為5×105個/mL，每孔100 μL，12 h 后加入不同質量濃度的TMPE，TMPE的質量濃度設定為0、0.01、0.1、1、10、100 μg/mL，每組6個復孔，加入10 μL CCK-8 進行細胞活力測定。

1.3.2 TMPE 抗炎效果檢測實驗取對數期RAW264.7 細胞懸液接種于96 孔板， 接種密度為5×105個/mL， 每孔100 μL，12 h 后加入LPS 刺激，設置空白對照組、LPS（1 μg/mL）組、LPS（1 μg/mL）+SMT（6 μmol/mL）組、LPS（1 μg/mL）+TMPE（0.01 μg/m）組、LPS（1 μg/mL）+TMPE（0.1 μg/mL）組、LPS（1 μg/mL）+TMPE（1 μg/mL）組、LPS（1 μg/mL）+ TMPE（1 μg/mL）組，每組6個復孔，作用24 h 后，收集上清液通過Griess 法測定上清液中的一氧化氮（Nitric oxide，NO）含量[12]，Elisa 測定TNF-α、IL-1β 的含量。

1.3.3 RNA 的提取、 反轉錄及定量取對數期RAW264.7 細胞懸液接種于6 孔板， 接種密度為1×106個/mL， 每孔2000 μL，12 h 后加入LPS 刺激，設置空白對照組，作用12 h 后，收集細胞并提取RNA 和蛋白質，RNA 的提取按照北京天根生化試劑說明書進行， 所提RNA 通過微量分光光度計測定濃度。并用1.2 g/dL 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的質量， 按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kits 說明書進行反轉錄。 按照Maxima SYBR Green qPCR Master Mix 說明書進行實時定量實驗測定mRNA 表達量，引物退火溫度均為60 ℃，至少5個復孔，其他參照說明書，采用2-ΔΔCt法進行數據表達量分析。 以GAPDH 作為管家基因，NCBI 中提供的mRNA成熟序列設計實時定量擴增引物。 引物序列如表1。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers

1.3.4 免疫印跡取對數期RAW264.7 細胞懸液接種于6 孔板，接種密度為1×106個/mL，每孔2000 μL，12 h 后加入LPS 刺激， 設置空白對照組，作用12 h 后，提取蛋白質，采用BCA 蛋白質定量試劑盒檢測總蛋白質的濃度，SDS-PAGE，轉膜，封閉，抗體孵育，ECL 顯色。

1.4 數據統計分析

用SPSS19.0 對試驗數據進行統計分析，所有試驗結果數值均用平均值±標準誤差表示。 選用單因素方差分析（ANOVA LSD），DUNCAN 多重比較和雙變量相關分析。

2 結果與分析

2.1 檢測結果

2.1.1 細胞活力檢測在測定TMPE 的抗炎活性前，先對TMPE 對細胞的影響進行評估，表2 顯示與未經處理的細胞對照組（0 質量濃度）相比，不同質量濃度的TMPE 對RAW264.7 作用不同。 在質量濃度0.01～10 μg/mL 的TMPE 測試范圍內觀察到的細胞存活率隨著劑量增加而增加，在TMPE 最大質量濃度為100 μg/mL 的時候，細胞存活率與對照組相比會顯著降低（P＜0.05），該濃度的細胞存活率僅為62%。在TMPE 質量濃度為0.1、1、10 μg/mL 時與對照組相比細胞存活率顯著增加（P＜0.05），在10 μg/mL 時TMPE 顯示出最高的存活率（172%）。

2.1.2 TMPE 對NO 生成的影響通過測試TMPE對NO 生成的抑制效果，驗證TMPE 的抗炎活性，結果顯示如圖1。 從圖中可以確定LPS 誘導的RAW264.7細胞，NO 的生成量相比對照組顯著增加（P＜0.05），在LPS 誘導的RAW264.7 細胞模型中加入不同質量濃度的TMPE （0.01、0.1、1 μg/mL 和10 μg/mL），NO 的產生量相比LPS 模型組均顯著降低（P＜0.05）（抑制率分別是38.21%、64.17%、58.16%和79.42%）。SMT（強的iNOS 抑制劑）顯著地降低了LPS 誘導的RAW264.7 細胞NO 產量（P＜0.05）（抑制率為45.24%）。

表2 不同質量濃度下細胞存活率Table 2 Survival rate of cells at different concentration

圖1 不同處理下NO 的產量Fig. 1 Production of NO under different treatments

2.1.3 TMPE 對TNF-α 和IL-1β 的影響在LPS誘導的RAW264.7 炎癥模型中，檢測TMPE 對炎性因子TNF-α 和IL-1β 生成的抑制效果， 結果見圖2。由圖表明，LPS 誘導的模型組中，TNF-α 和IL-1β的質量濃度均顯著高于對照組（P＜0.05），加入0.01、0.1、1、10 μg/mL 的TMPE 后均能顯著降低TNF-α（抑制率分別是27.91%、36.31%、36.14%、45.09%）和IL-1β 的產生 （抑制率分別是47.75%、58.47%、60.21%、64.55%）（P＜0.05）。 綜合細胞活力，NO 生成量實驗和本實驗結果。 TMPE 的質量濃度在后續的實驗中，確定為在10 μg/mL。

圖2 不同處理下TNF-α 和IL-1β 的質量濃度Fig. 2 Contents of TNF- alpha and IL-1 beta under different treatments

圖3 mRNA 相對表達量Fig. 3 Expression levels of genes

2.1.4 基因表達量檢測用10 μg/mL 的TMPE 處理細胞基因mRNA 表達量見圖3，與空白組相比較LPS 模型組，相關炎癥基因（iNOS、COX-2、NF-κB、STAT3、HIF-1α）的表達量均顯著提高（P＜0.05），在LPS+TMPE（10 μg/mL）組中，相關炎癥基因的表達量除NF-κB基因外， 其他炎癥相關基因（iNOS、COX-2、STAT3、HIF-1α）的表達量與LPS 模型組均顯著降低（P＜0.05），iNOS、COX-2 和HIF-1α 基因的表達量仍然顯著高于對照組（P＜0.05），其中STAT3的表達量降低程度比對照組的更低， 且差異顯著（P＜0.05）。

2.1.5 免疫印跡檢測結果用10 μg/mL 的TMPE處理細胞免疫印跡結果見圖4， 通過免疫印跡檢測TMPE 對炎癥相關蛋白質（COX-2，NF-κB，STAT3，HIF-1α） 表達的影響，LPS 模型組與對照組相比炎癥相關蛋白質（COX-2、NF-κB、STAT3、HIF-1α）的表達量均有所增加， 其中COX-2 和STAT3 的蛋白質增加量最多，NF-κB 和HIF-1α 蛋白質表達量增加次之。LPS+TMPE 組與LPS 模型組相比，除NF-κB蛋白質變化不明顯， 其他蛋白質 （COX-2，STAT3，HIF-1α）的表達量均有降低，特別是STAT3 蛋白質的表達量。在LPS+TMPE 組中STAT3 蛋白質的表達量比對照組都低。

圖4 免疫印跡結果Fig. 4 Results of western blot

2.2 討論

食用菌種類繁多，營養豐富，富含各種氨基酸、脂肪酸、多糖等多種營養成分，口味豐美，同時具有增強免疫力、抗腫瘤、降血糖血脂等藥用功能[13-14]。野生蒙古口蘑稀有、綠色、純天然，倍受大家的追捧。 研究發現，蘑菇多糖提取物具有抗炎等多種藥理活性[15]，本實驗通過LPS 誘導RAW264.7 細胞的炎癥模型， 質量濃度在0.01～10 μg/mL 的TMPE 測試范圍內觀察到的細胞存活率、NO 生產抑制率及炎性因子TNF-α 和IL-1β 生成的抑制效果隨著劑量增加而增加， 質量濃度10 μg/mL 時TMPE 顯示出最高的細胞存活率（172%），NO 的最大抑制效果（45.24%），TNF-α 和IL-1β 生成最大的抑制效果（分別為58.47%、65.86%）。 蒙古口蘑多糖提取物有望成為新的抗炎藥物。

炎癥因子TNF-α 和IL-1β 的產生受轉錄因子NF-κB 和STAT3 的調控[16]，NO 是由iNOS 和COX-2催化合成的，研究表明甲醇、乙醇提取不同蘑菇的多糖均可以抑制NO 的生成[17-18]，炎癥的發生與iNOS和COX-2 的過表達有關[19]，iNOS 和COX-2的表達受轉錄因子NF-κB、STAT3 及HIF-1α 調控[20]， 抑制JAK2-STATs 活性會導致LPS 誘導的NO 產生及iNOS 的表達[21]，激活HIF-1α 通路會增加NO 的表達[22]。 本實驗中選擇HIF-1α、NF-κB、STAT3、COX-2、iNOS 作為研究對象， 定量結果顯示，TMPE 會導致iNOS、COX-2、STAT3、HIF-1α 的表達量降低，免疫印跡結果顯示，TMPE 會導致COX-2、STAT3、HIF-1α 蛋白質的表達量降低， 而NF-κB 的mRNA表達量及蛋白質質量均變化不明顯， 因此可以推斷TMPE 的抗炎作用主要通過調節轉錄因子STAT3和HIF-1α 的表達進而調節iNOS 和COX-2 的表達，而不主要通過轉錄因子NF-κB 的變化發揮抗炎作用，也就是說TMPE 通過JAK-STAT3 及HIF-1α信號通路實現抗炎的效果。

3 結語

通過LPS 誘導RAW264.7 細胞的炎癥模型，發現蒙古口蘑多糖提取物在不同濃度下具有不同質量的抗炎活性， 通過對HIF-1α、NF-κB、STAT3、COX-2、iNOS基因及蛋白質的表達確定蒙古口蘑多糖提取物主要通過JAK-STAT3 及HIF-1α 信號通路，而不主要通過NF-κB 信號通路，抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β 和NO 的釋放，進而發揮抗炎作用。