C4ST-1 在大腸桿菌中的可溶性表達

李 青， 周正雄， 堵國成，2， 李江華*，2， 康 振，2

（1. 江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122；2. 江南大學 糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122）

硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）是一類由葡萄糖醛酸和GalNAc 交替組成，并在GalNAc 不同位點硫酸化的線性陰離子多糖[1]。 CS 為防治關節病[2-3]和修復受損的中樞神經系統[4-5]的最佳藥物，同時廣泛地應用于食品領域[6]。 CS 根據其硫酸化位點不同可分為CSA、硫酸軟骨素C（chondroitin sulfate C，CSC）等[7-8]。 目前，CSA 主要從氣管、鯊魚軟骨[9]等動物軟骨組織中提取得到。 但由于動物組織中提取的硫酸軟骨素存在過硫酸化、 產品難以保證一致性、可能攜帶潛在致病因子等因素[10]限制了CSA 的進一步應用。 作者在前期研究中提出兩步法得到CSA。首先，以Bacillus subtilis 為宿主發酵生產軟骨素[11]；然后以Pichia pastoris 發酵生產的C4ST-1 催化軟骨素形成結構單一的CSA[12]。

但相比于Pichia pastoris，E. coli 具有生長速度快，培養簡單，遺傳背景清楚等優點，其成為重組蛋白表達的首選。 但該系統缺乏蛋白質翻譯后修飾系統，表達的C4ST-1 經常錯誤折疊成形成包涵體[12-13]。在本課題組前期工作中， 將來源于小鼠的C4ST-1在E. coli 中成功地進行了表達，表達產物基本上都以包涵體形式存在。 C4ST-1 含3 對二硫鍵， 在E.coli 胞質還原性環境中可能會使C4ST-1 的二硫鍵無法折疊或不正確折疊。 近年來，人們利用硫氧還蛋白還原酶（TrxB）和谷胱甘肽還原酶（Gor）雙突變工程菌株[14-17]，融合氧化性硫氧還蛋白A（TrxA）[18]，或者引進二硫鍵從頭形成體系[19]等策略，在E. coli胞質中成功實現了多種二硫鍵蛋白的表達。 有文獻報道表明Orgami（DE3）等工程菌株不能催化二硫鍵的從頭合成，蛋白質產率可能較低[20]。 Erv1p（EC 1.8.3.2）可以催化二硫鍵從頭形成，向E. coli 細胞質引入二硫鍵從頭形成體系，可能會大幅提高活性蛋白質的產率[20-24]。 DsbC（EC 5.3.4.1）在細胞質過量表達能夠促進外源蛋白質的二硫鍵正確配對和異構化，進而提高胞質可溶性蛋白質表達水平[25-26]。 本研究通過在E. coli 中共表達Erv1p、 DsbC 及C4ST-1，以期實現胞內可溶性蛋白質產量和酶活的提高。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 宿主和質粒菌株E. coli JM109，E. coli BL21（DE3），Saccharomyces cerevisiae S288C 及質粒pET-32a（+），pRSFDuet1 均為本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑和儀器質粒DNA 小量制備試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、酵母基因組提取試劑盒和細菌基因組提取試劑盒，均購自上海生工生物工程股份有限公司；DNA 標準相對分子質量片段、各種限制性內切酶、DNA 連接酶，均購于大連寶生物工程有限公司；一步法克隆試劑盒，購自NEB公司；SDS-PAGE 預制膠， 標準相對分子質量蛋白質，購自Thermo 公司；胰蛋白胨、酵母提取物，購自英國OXOID 公司；對硝基硫酸苯酯（PNPS）、3′-磷酸腺苷-5′-磷酸（PAP），均購自Sigma-Aldrich 公司；軟骨素制備參照文獻[11]，芳基硫磺基轉移酶（ASTIV，EC 2.8.2.1）制備參照文獻[12]，其他試劑均為國產分析純。

DYY-6D 型瓊脂糖水平電泳槽，購自北京六一生物科技有限公司；蛋白膠電泳槽，購自Thermo 公司；VCX750 型超聲破碎儀， 購自美國SONICS 公司；UV2450 型紫外可見分光光度計，購自日本島津公司；Avanti J-26XP 低溫高速冷凍離心機， 購自美國Beckman Coulter 公司。

1.1.3 培養基及培養條件LB 液體培養基（g/L）：胰蛋白胨10， 酵母提取物5，NaCl 10；pH 調為7.2（固體培養基添加2 g/dL 瓊脂粉）。

TB 培養基（g/L）：胰蛋白胨12，酵母提取物24，甘油6，KH2PO4，2.31，K2HPO412.54。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的獲得

1）C4ST-1 的獲得 在NCBI 數據庫檢索來源于小鼠的C4ST-1 （NP_067414） 氨基酸序列，經TMHMM 軟件預測分析C4ST-1 的第17-37 位氨基酸區域為跨膜區， 因此第38-352 位氨基酸所對應的基因序列（GenBank：AAI37630.1）按照E. coli密碼子偏好性由南京金斯瑞生物科技有限公司進行全基因合成。

2）Erv1p的獲得 采用酵母基因組提取試劑盒提取S. cerevisiaeS288C 基因組。 以S. cerevisiaeS288C 基因組為模板，設計引物F1 和R1，PCR 擴增獲得Erv1p（GenBank：DAA08125.1）。

3）DsbC的獲得 采用細菌基因組提取試劑盒提取E. coliBL21 （DE3） 基因組。 以E. coliBL21（DE3）基因組為模版，設計引物F2 和R2，PCR 擴增獲得去除信號肽編碼序列的DsbC（GenBank：CAQ33205.1）。

1.2.2 重組載體的構建

1）pET-32a（+）-C4ST-1 的構建 設計引物F3和R3 將質粒pET-32a（+）線性化。 設計與線性化質粒pET-32a（+）含有同源臂的引物F4 和R4，以合成的C4ST-1 為模板，PCR 擴增得到C4ST-1 產物。 將兩步所得產物進行同源重組，轉化E. coliJM109 感受態，挑取轉化子測序，測序正確即獲得重組質粒pET-32a（+）-C4ST-1，見圖1。

圖1 質粒pET32a（+）-C4ST-1 構建過程Fig. 1 Schematic of the construction of plasid pET32a（+）-C4ST-1

2）pRSFDuet1-Erv1p的構建 設計引物F5 和R5 將質粒pRSFDuet1 線性化。 將PCR 擴增獲得的Erv1p片段與線性化質粒pRSFDuet1 進行同源重組，轉化E. coliJM109 感受態，挑取轉化子，測序正確則重組質粒pRSFDuet1-Erv1p構建成功，構建過程見圖2（a）。

3）pRSFDuet1-DsbC的構建 設計引物F6 和R6 將質粒pRSFDuet1 線性化。 將PCR 擴增獲得的DsbC與線性化質粒pRSFDuet1 進行同源重組，轉化E. coliJM109 感受態，挑取轉化子，測序正確則重組質粒pRSFDuet1-DsbC構建成功， 構建過程見圖2（b）。

4）pRSFDuet1-Erv1p-DsbC的構建 利用引物F7 和R5 將質粒pRSFDuet1-DsbC線性化。 用引物F1 和R7 進行PCR 擴增得到Erv1p與線性化載體pRSFDuet1-DsbC進行同源重組。 轉化E. coliJM109 感受態，挑取轉化子測序，測序正確獲得重組質粒pRSFDuet1-Erv1p-DsbC，構建過程見圖2（c）。本文中所用引物均列于表1 中。

圖2 表達載體pRSFDuet1-Erv1p、pRSFDuet1-DsbC、pRSFDuet1-Erv1p-DsbC 的構建Fig. 2 Construction of pRSFDuet1-Erv1p，pRSFDuet1-DsbC and pRSFDuet1-Erv1p-DsbC

1.2.3 重組載體的轉化與誘導表達挑取測序正確的重組質粒轉化E. coliBL21（DE3），挑取單菌落接種于裝有3 mL LB 液體培養基 （含有50 μg/mL氨芐青霉素或卡那霉素）的12 mL 搖菌管中，37 ℃、220 r/min 過夜培養。 種子液按體積分數2%接種量轉接至含50 mL TB （含有50 μg/mL 氨芐青霉素或卡那霉素）的250 mL 三角瓶中，37 ℃、220 r/min 培養至OD6000.6～0.8 左右， 添加終濃度為0.5 mmol/L的IPTG 誘導，25 ℃誘導表達16 h，收集菌體。

表1 PCR 擴增引物Table 1 Primers for PCR amplification

1.2.4 重組載體胞內粗酶液制備及其SDS-PAGE檢測

1） 粗酶液制備 發酵結束后，將誘導表達產物于4 ℃、7000 r/min 離心10 min，棄上清液。 用pH 7.0的20 mmol/L Tris-HCl 將菌體洗滌2次， 稀釋至OD6002.0～3.0，在冰上超聲破碎（功率300 W，工作4 s，間歇6 s，10 min）。 4 ℃、12000 r/min 離心30 min，分別收集上清液與沉淀。所得上清液即為粗酶液，沉淀用與上清液同體積的pH 7.0 的20 mmol/L Tris-HCl 重懸，備用。

2） SDS-PAGE 檢測 取30 μL 待檢測樣品，加入10 μL 的4×上樣緩沖液混勻，于72 ℃變性10 min。取20 μL 變性樣上樣，120 V 開始電泳，當溴酚藍指示劑遷移到距底部1～2 cm 處停止電泳。 電泳結束后， 取出膠塊， 使用質量分數0.1%的考馬斯亮藍R250 染色液染色30 min 后純水脫色， 至背景顏色較淺，凝膠成像分析儀拍照備用。

1.2.5 C4ST-1 的酶活性測定參照本課題組前期工作[12]，向1 mL 20 mmol/L 的Tris-HCl（pH 7.0）反應緩沖體系中添加50 mmol/L PNPS，0.5 mmol/L PAP，2 mg ASST IV ，100 mg 軟骨素，粗酶液2 mg，于37 ℃反應2 h。 以不加底物或將粗酶液加熱失活作為陰性對照，沸水浴100 ℃、5 min 終止反應。 酶活力單位的定義為： 在最適反應條件 （37 ℃，pH 7.0）下，1 h 內催化生成1 μmol/L PNP 所需的酶量。

2 結果與分析

2.1 目的基因的擴增和重組載體的構建

2.1.1 pET-32a （+）-C4ST-1 的構建以合成的C4ST-1 為模板， 引物F3 和R3 進行PCR 擴增，擴增得到大約900 bp 的片段，見圖3（a）。 采用DNA純化回收試劑盒對單一凝膠片段進行回收，回收后的C4ST-1 片段與用引物F4 和R4 擴增得到的線性質粒pET-32a （+）（圖略） 同源重組， 轉化E. coli JM109， 挑取轉化子交由上海生工生物工程有限公司測序， 測序結果正確， 重組載體pET-32a （+）-C4ST-1 構建成功。

2.1.2 pRSFDuet1-Erv1p 的構建以S. cerevisiae S288C 基因組為模板，引物F1 和R1 進行PCR 擴增獲得約570 bp 的Erv1p 片段，見圖3（b）。 將回收的Erv1p 片段和用引物F5 和R5 進行PCR 擴增得到的線性化載體pRSFDuet1（圖略）進行同源重組，轉化E. coli JM109，挑取轉化子測序，測序結果顯示正確，重組載體pRSFDuet1-Erv1p 構建成功。

2.1.3 pRSFDuet1-DsbC 的構建以E. coli BL21（DE3）基因組為模版，設計引物F2 和R2，PCR 擴增獲得去除信號肽的約600 bp 的DsbC 片段，見圖3（c）。 將回收的DsbC 片段與引物F6 和R6 進行PCR 擴增得到的線性化載體pRSFDuet1（圖略）進行同源重組，轉化E. coli JM109 菌株，挑取轉化子測序，測序結果顯示正確，重組載體pRSFDuet1-DsbC構建成功。

圖3 PCR 產物的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig. 3 Analysis of PCR products by agarose gel electrophoresis

2.1.4 pRSFDuet1-Erv1p-DsbC 的構建設計引物F7 和R5 PCR 擴增得到線性化載體pRSFDuet1-DsbC （圖略）。 用引物F1 和R7 進行PCR 擴增得到的Erv1p 片段（圖略）與線性化載體pRSFDuet1-DsbC 同源重組，轉化E. coli JM109 菌株，挑取轉化子測序，測序結果顯示正確。

2.2 C4ST-1 在E. coli 胞質表達的SDS-PAGE分析

將測序正確的重組質粒pET-32a （+）-C4ST-1轉化E. coli BL21（DE3）感受態細胞，獲得命名為E.coli BL21（DE3）- pET-32a（+）-C4ST-1 的宿主菌。以轉化空質粒pET-32a（+）為對照。 挑取重組菌單菌落進行搖瓶水平發酵，發酵結束后對其胞內上清液及胞內沉淀進行SDS-PAGE 檢測分析。結果如圖4 所示，與對照相比，重組菌在沉淀的5.2×104處有一明顯條帶，上清中未觀察到明顯條帶。 即C4ST-1在E. coli 胞質中主要以包涵體的形式存在。

2.3 共表達DsbC 對C4ST-1 的影響

以重組菌E. coli BL21 （DE3）- pET-32a （+）-C4ST-1 為出發菌株制備感受態細胞。 將重組質粒pRSFDuet1-DsbC 通過熱擊的方法轉化至上述感受態細胞中，以轉化空質粒pRSFDuet1 為對照。 重組菌經過搖瓶發酵， 超聲破碎后進行SDS-PAGE 分析，結果見圖5。 DsbC 重組蛋白在E. coli 中成功的進行了表達，其中DsbC（Mr＝2.6×104）以胞內可溶形式表達（泳道3 藍色箭頭所示）。 C4ST-1 重組蛋白單獨表達時主要以包涵體形式存在（泳道2），可溶部分未見明顯條帶 （泳道1）； 共表達DsbC 導致C4ST-1 重組蛋白大部分以可溶形式存在 （第3 泳道），小部分以包涵體形式存在（第4 泳道）。 將各重組菌株進行搖瓶發酵，菌體超聲破碎后所得上清液進行酶活測定， 結果見圖6。 對照菌株的酶活為（9.42±0.29） U/L，DsbC 和C4ST-1 共表達菌株的酶活為（21.99±0.42） U/L，是對照菌株的2.33 倍。

圖4 C4ST-1 表達的SDS-PAGE 分析Fig.4 SDS-PAGE result of expression product of C4ST-1

2.4 共表達Erv1p 對C4ST-1 的影響

C4ST-1 和Erv1p 共表達菌株的轉化過程同2.3，將此菌株通過搖瓶發酵，超聲破碎后進行SDSPAGE 分析，結果見圖5。 Erv1p 在E. coli 中成功地進行了表達，Erv1p（Mr＝2.63×104）以胞內可溶（泳道5 紅色箭頭所示）和不溶的2 種形式存在（泳道6 紅色箭頭所示）。共表達Erv1p 也能導致C4ST-1 融合蛋白部分以可溶形式存在（第5 泳道），但大部分仍以包涵體形式存在（第6 泳道）。即C4ST-1 與Erv1p共表達可在一定程度上促進C4ST-1 的可溶性表達，但其對C4ST-1 的可溶性表達影響相對較小。這可能因為Erv1p 為直接從酵母基因組中擴增得到，含有大量E. coli 稀有密碼子， 在E. coli 中可溶性表達的量較少，故對C4ST-1 的促進作用有限。可根據E. coli 密碼子偏好性將Erv1p 進行全基因合成，或以含有E. coli 稀有密碼子的Rosetta（DE3）為宿主進行表達。 將C4ST-1 和Erv1p 共表達菌株進行酶活測定，結果見圖6。 Erv1p 和C4ST-1 共表達菌株的酶活達到 （12.32±0.76） U/L， 是對照菌株的1.30 倍。

2.5 共表達Erv1p 和DsbC 對C4ST-1 的影響

C4ST-1、Erv1p 和DsbC 共表達菌株的轉化 過程同2.3，將此菌株通過搖瓶發酵，超聲破碎后進行SDS-PAGE 分析，結果見圖5。 Erv1p 和DsbC 重組蛋白均在E. coli 中成功地進行了表達， 其中Erv1p（Mr＝2.63×104）以胞內可溶（泳道7 紅色箭頭所示）和不溶 （泳道8 紅色箭頭所示） 的2 種形式存在；DsbC（Mr＝2.6×104）以胞內可溶形式表達（泳道7 藍色箭頭所示）。 同時共表達C4ST-1、Erv1p 和DsbC導致C4ST-1 重組蛋白部分大部分以可溶形式存在（第7 泳道）， 但沉淀仍見部分包涵體蛋白質條帶（第8 泳道）。 將此重組菌株進行搖瓶發酵，菌體超聲破碎后所得上清液進行酶活測定， 結果見圖6。C4ST-1、Erv1p 和DsbC 共表達菌株的酶活比對照菌株增加2.09 倍，酶活最高可達（29.12±0.66） U/L。

圖5 共表達Erv1p 和DsbC 對C4ST-1 表達的影響Fig. 5 Effect of co-expression of Erv1p and DsbC on C4ST-1

圖6 共表達Erv1p 和DsbC 對C4ST-1 酶活的影響Fig. 6 Effect of co-expression of Erv1p and DsbC on C4ST-1 enzyme activity

2.6 C4ST-1、Erv1p 和DsbC 共表達菌株3 L 罐培養

為考察同時共表達C4ST-1、Erv1p 和DsbC 的菌株能否進一步工業化應用， 將此菌株進行3 L 罐發酵培養。 發酵過程控制轉速250 r/min、溶氧水平在體積分數20%～30%、pH 7.0（流加氨水）左右、起始溫度37 ℃，加入IPTG 后溫度降低至25 ℃。 將保藏在甘油管的菌種接于LB 固體斜面培養基上進行活化，37 ℃培養過夜。挑取斜面菌種接入LB 液體培養基，37 ℃培養10 h 左右。 將種子液以體積分數為4%的接種量轉接至裝有1 L TB 培養基的3 L 發酵罐中，定時取樣測定OD600和酶活，結果見圖7。當菌體生長2 h 左右進入對數生長期， 加入終濃度為0.5 mmol/L 的IPTG 進行誘導表達。 當IPTG 誘導至10 h 左右菌體生長進入穩定期， 其酶活達到49.97 U/L。 繼續延長培養時間，菌體生長不明顯且酶活有所下降， 故10 h 左右為菌體的最佳產酶時間，為進一步的工業化應用提供技術支持。

圖7 3 L 發酵罐酶活變化曲線Fig. 7 Variation curve of enzyme activity under the fermentation condition

3 結 語

本研究中成功在E. coli 中表達了老鼠來源的C4ST-1， 但表達產物基本上以包涵體的形式存在，限制了其大規模應用。 C4ST-1 含7個不連續的半胱氨酸殘基，當蛋白質含有2個以上的非連續二硫鍵時，其錯誤配對幾率增大，異常的二硫化物需要異構化才能使蛋白質達到天然構象[27]。 為獲得高可溶性表達和高活性的C4ST-1 重組蛋白， 本研究中共表達了參與二硫鍵從頭形成的Erv1p 和促進二硫鍵正確配對和異構化的DsbC。 結果表明DsbC 和Erv1p 對C4ST-1 的可溶性表達量和酶活均有一定程度的提高。將C4ST-1、DsbC 和Erv1p 同時共表達的菌株進行3 L 發酵罐放大培養，10 h 左右酶活達到49.97 U/L，是原始菌株搖瓶的5.30 倍，對C4ST-1 的廣泛應用奠定了一定的基礎。 但本研究中對活性蛋白質的產生條件只進行了初步探索，重組蛋白仍有一大部分以包涵體的形式存在。 為進一步提高其可溶性表達量和酶活，一方面可以通過以胞質呈現氧化性環境的Shuffle 菌株[28-30]為宿主進行表達，另一方面可通過優化培養基、培養條件、構建不同的融合表達系統等進行嘗試表達。