富含莫納可林K 燕麥紅曲的快速發酵

李堅華， 徐 方， 吳佩芝， 胡 婷， 馮艷麗

（1. 湖北師范大學 食用野生植物保育與利用湖北省重點實驗室， 湖北 黃石435002；2. 湖北師范大學 生物學國家級實驗教學示范中心，湖北 黃石435002；3. 湖北師范大學 生命科學學院，湖北 黃石435002）

燕麥是少數同時具有營養、保健和藥用價值的糧食作物之一。 燕麥富含淀粉、蛋白質、膳食纖維、亞油酸、維生素E 和多酚等物質[1]。 1997年，美國食品藥品管理局認定燕麥為功能性食物，它具有降低膽固醇、平穩血糖等功效[2]。 燕麥主要分為2 種，一種是帶稃型的皮燕麥， 另一種是無稃型的裸燕麥。其中裸燕麥的蛋白質、脂肪、氨基酸、黃酮等營養和功能活性物質含量顯著高于皮燕麥[3]。 燕麥中蛋白質、油脂和可溶性纖維素含量均居谷物之首，其淀粉含量在50.0%～65.0%之間，比玉米和小麥等所含淀粉更易于糊化，且其含有大量膳食纖維使其具有較高的持水性和膨脹力， 是良好的微生物發酵基質，可用于紅曲菌等的固態發酵[4-5]。

紅曲菌（Monascus spp.）是我國具有傳統特色的藥食兩用微生物資源。 紅曲是指將紅曲菌接種于淀粉質原料發酵而成的產品，其成品的顏色多呈赤紅色或紫紅色。 因紅曲菌可發酵產生多種功能性代謝產物如莫納可林K （Monacolin K，MK）、 紅曲色素（Monascus pigments，MPs）、γ-氨基丁酸、 麥角甾醇等而被廣泛應用于食品著色和防腐、 營養保健、釀造及醫藥等領域[6]。MK 可作為HMG-CoA 還原酶的競爭性抑制劑，進而抑制膽固醇的合成[7]，在調節血壓、血脂等方面得到廣泛應用[8]。 MPs 是紅曲菌產生的一系列色素的混合物， 它不僅可用作天然著色劑，還具有多種生理功能如抗癌、調節血糖、減肥等[6，9]。 目前有關紅曲發酵產MK 的研究較多，但普遍存在產量低、周期長、質量不穩定、成本高等問題。

目前， 我國燕麥的加工形式主要包括燕麥片、燕麥粉等，對燕麥的精深加工和綜合利用較少。 雖有部分地區如臺灣等地銷售紅曲燕麥片等，但大都以紅曲米為原料添加至燕麥片中制成，而完全利用燕麥為基質生產的功能性燕麥紅曲產品極少[10]。 盧穎[11]在燕麥培養基中添加酵母粉、甘油等，研究了燕麥紅曲固態發酵中MK、蛋白質、多糖、黃酮等物質的生物轉化，在優化后的培養基參數下發酵14 d 后MK 產量可達15.00 mg/g。減少發酵基質中非常規食用物質的添加，是開發新型功能紅曲的努力方向。

本研究中以裸燕麥 （文中涉及燕麥均指裸燕麥）為原料，以可高產MK 且不產桔霉素的叢毛紅曲菌（Monascus pilosus）MS-1 為實驗菌株，從裸燕麥的預處理、酸度及微量元素等方面優化燕麥紅曲固態培養基。 在此基礎上，通過添加營養因子刺激MK 的產生。 該研究擬在獲得富含MK 燕麥紅曲的基礎上，與已有報道相比，縮短發酵周期。 該研究結果可為燕麥精深加工提供新思路，對提高功能性紅曲的生產效率也具有借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株叢毛紅曲菌 （Monascus pilosus）MS-1 （中國典型培養物保藏中心， 編號CCTCC M 2013295） 是由紅曲產品中分離獲得的可高產MK不產桔霉素的紅曲菌株。

1.1.2 儀器設備Agilent 1260 高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司產品；UV754N 紫外分光光度計： 上海儀電分析儀器有限公司產品；Anke TJL-18G-C 離心機：上海安亭有限公司產品；HZQ-F160振蕩培養箱：哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司產品；BCM-1300A 生物潔凈工作臺：蘇凈集團安泰公司產品；LRH-80 生化培養箱：武漢—恒蘇凈科學儀器有限公司產品；DHG-9070A 電熱恒溫鼓風干燥機：武漢—恒蘇凈科學儀器有限公司產品。

1.1.3 試劑及溶液MK 標準品：購于Sigma 公司；常規試劑乙腈、磷酸、葡萄糖、瓊脂、蛋白胨、無水乙醇、七水硫酸鎂、氯化鈣、七水硫酸鋅、硫酸錳、七水硫酸亞鐵、氫氧化鈉、磷酸二氫銨、冰乙酸和乳酸中除乙腈為色譜純外均為分析純：主要購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.4 培養基PDA 培養基：土豆200 g/L（煮制成土豆汁，棄去殘渣），葡萄糖20 g/L，瓊脂粉20 g/L；pH 自然， 以每瓶約100 mL 的量分裝至茄形瓶中。于121 ℃滅菌20 min 后擺斜面備用。此培養基用于紅曲菌的傳代培養。

種子液培養基[12]：葡萄糖80 g/L，蛋白胨10 g/L，NH4H2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L， 無 水CaCl20.1 g/L， 土豆汁替代水溶解試劑；pH 自然， 以每瓶150 mL 的量分裝至500 mL 三角瓶中，121 ℃滅菌20 min 冷卻備用。 此培養基用于制備紅曲菌種子液。

固態發酵培養基：250 mL 三角瓶的裝樣量為75 g（不包括酸及無機鹽），燕麥干質量50 g，蒸餾水25 g，根據實驗需要添加酸、無機鹽等，在121 ℃下滅菌20 min，趁熱打散后備用。 此培養基用于燕麥紅曲固態發酵。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子液的制備以無菌水將在30 ℃培養10 d的紅曲菌孢子洗下，調整孢子懸液濃度為106CFU/mL，以10 mL/hg 的接種量將上述孢子懸液接入1.1.4 的種子液培養基中，在30 ℃、120 r/min 培養48 h。

1.2.2 MK 的檢測將發酵后的燕麥紅曲于55 ℃烘干12 h，粉碎后充分混勻。 準確稱取0.3 g 試樣于50 mL 離心管中， 加入10 mL 體積分數75%乙醇。在室溫下超聲提取1 h，靜置10 min，取4 mL 上清液在8000 r/min 離心10 min。 取上清液過0.22 μm濾膜，收集濾液待測。采用HPLC 法檢測分析樣品中MK 含量， 其色譜條件為：HPLC 系統為安捷倫1260， 色譜柱：Inertsil ODS-3 （5 μm，4.6 mm×250 mm）。 檢測波長為238 nm，流動相為乙腈∶水∶體積分數0.5%磷酸＝60∶37∶3（體積比），流速為1 mL/min，柱溫為25 ℃，進樣量為20 μL[13-14]。 紅曲樣品中MK質量分數的計算公式為：

式（1）中，A0為酸式MK 峰面積；A1為內酯式MK 峰面積；C0為標準品質量濃度（μg/mL）；I 為稀釋倍數；A 為標準品峰面積；10 為提取液總體積（mL）；0.3 為稱樣質量（g）。

1.2.3 MPs 的檢測檢測樣品的預處理同1.2.2。取上清液1 mL 并用75%乙醇稀釋至合適的濃度后于505 nm 處測光吸收（OD）值[15]，計算色價。 色價計算公式為：

式（2）中，M 為稀釋倍數。

1.2.4 燕麥浸泡時間對紅曲菌產MK 的影響根據預實驗得知，以蒸餾水浸泡燕麥8、10、12 h 后，含水質量分數基本恒定。 每個250 mL 三角瓶中分裝50 g 燕麥， 分別用蒸餾水浸泡燕麥8 h 和12 h，瀝干后在121 ℃滅菌20 min 并趁熱打散。將培養好的種子液按10 mL/hg 的接種量接入固態培養基中，先在30 ℃培養3 d，再調至25 ℃培養至14 d[12]，分析發酵產物中MK 的含量，其檢測方法同1.2.2。

1.2.5 燕麥粉碎處理對紅曲菌產MK 的影響以未處理的燕麥為對照， 將燕麥分別粉碎至20 目和10 目。 燕麥紅曲的接種及培養條件同1.2.4，分析發酵產物中MK 的含量，其檢測方法同1.2.2。

1.2.6 加水方式對紅曲菌產MK 的影響在1.2.5實驗結果的基礎上，設置固體培養基加水方式分別為滅菌前、后各加質量分數16.67%的水分和滅菌前一次加質量分數33.34%的水分，燕麥紅曲的接種及培養條件同1.2.4， 分析發酵產物中MK 的含量，其檢測方法同1.2.2。

1.2.7 滅菌前加水質量分數對紅曲菌產MK 的影響在1.2.6 的基礎上， 將固體培養基滅菌前加水質量分數分別調整為16.67%、20.00%、23.33%、26.67%、30.00%， 經滅菌后將各培養基的加水質量分數補足至33.34%。燕麥紅曲的接種及培養條件同1.2.4，分析發酵產物中MK 的含量，其檢測方法同1.2.2。

1.2.8 乳酸、 冰乙酸添加量對紅曲菌MK 的影響在1.2.7 的基礎上， 在固態培養基中分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL/hg 的乳酸、冰乙酸，滅菌和發酵培養方法同1.2.4。檢測紅曲發酵產物中MK 的含量，具體檢測方法1.2.2。 為比較冰乙酸和乳酸的穩定性，用pH 計測定培養基提取液的pH，并采用酸堿滴定的方法測定培養基中乳酸、 冰乙酸含量。以0.1 g/dL 酚酞溶液為指示劑， 用0.1 mol/L 的NaOH 溶液滴定滅菌前后樣品提取液。

乳酸、冰乙酸酸質量分數的計算公式：

式中：X 為每千克樣品中總酸的克數，g/kg；C 為氫氧化鈉標準滴定溶液的濃度，mol/L；V1為滴定試液時消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積，mL；V2為空白試驗消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積，mL；V3為樣品稀釋液總體積，mL；V4為滴定時吸取的樣液體積，mL；m 為樣品質量，g；K 為酸的換算系數 （乳酸：0.090；冰乙酸：0.060）

1.2.9 金屬離子對紅曲菌產MK 的影響在1.2.8的基礎上， 在固態培養基中分別添加0.007 mol/kg的ZnSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4、FeSO4·7H2O和CaCl2，燕麥紅曲的接種及培養條件同1.2.4，分析發酵產物中MK 的含量，其檢測方法同1.2.2。

1.2.10 鎂離子添加量對紅曲菌產MK 的影響在1.2.9 的基礎上，將固體培養基中MgSO4·7H2O 的添加量分別調整為0、0.002、0.007、0.012、0.017、0.022 mol/kg，燕麥紅曲的接種及培養條件同1.2.4，分析發酵產物中MK 的含量，其檢測方法同1.2.2。

1.2.11 大豆分離蛋白添加量對紅曲菌產MK 的影響在1.2.10 的基礎上，將固體培養基中的大豆分離蛋白分別調整為0%、1%、2%、3%、4%、5%（質量分數），燕麥紅曲的接種及培養條件同1.2.4，分析發酵產物中MK 的含量，其檢測方法同1.2.2。

1.2.12 發酵時間對紅曲菌產MK 和MPs 的影響在1.2.11 優化得到的固體培養基基礎上，監測發酵32 d 內紅曲菌產MK 和MPs 的變化趨勢，以發酵5 d 為取樣起始天數，間隔3 d 取樣。 燕麥紅曲的接種及培養條件同1.2.4，發酵產物中MK 和MPs 的檢測方法同1.2.2 和1.2.3。

2 結果與分析

2.1 燕麥浸泡時間對紅曲菌產MK 的影響

預實驗結果表明，燕麥浸泡8、10 h 及12 h 時，其含水質量分數為（32.85±0.07）%，說明浸泡8 h 時燕麥的吸水量已達到飽和。 因水分在燕麥組織中的分布及存在狀態可隨浸泡時間的長短而改變，探究燕麥含水量達到飽和后， 浸泡時間對燕麥紅曲MK產量的影響，結果如圖1 所示。

圖1 浸泡時間對紅曲菌產MK 的影響Fig. 1 Effects of soaking time on MK production by Monascus spp.

由圖1 可知，浸泡8 h 與12 h 的燕麥，經發酵14 d 后MK 產量無顯著差異（p＞0.05），表明燕麥吸水量達到飽和后，浸泡時間對紅曲菌產MK 沒有影響。 此外，嘗試在浸泡液中添加冰乙酸、金屬離子等，發現MK 產量偏低，即MK 的最高產量不超過5 mg/g（數據未列出），且發酵所得的燕麥紅曲米心呈乳白色。 表明紅曲菌只沿物料表面生長，不能充分利用粒狀燕麥。 故在后續實驗中，將對燕麥基質進行適當的粉碎處理。

2.2 燕麥粉碎處理對紅曲菌產MK 的影響

為探究粉碎度對燕麥紅曲固態發酵產MK 的影響，對燕麥進行不同細度的粉碎處理后進行固態發酵，結果如圖2 所示。 對燕麥進行粉碎處理可顯著促進紅曲菌發酵產MK（p＜0.05），其中粉碎度為20 目時效果最好，MK 產量最高可達7.95 mg/g，比對照提升了1.59 倍。這是由于粉碎處理增大了紅曲菌與物料的接觸面積， 同時有利于燕麥淀粉的糊化，但粉碎細度過小會使基質不易被打散（預實驗中粉碎粒度小于20 目時滅菌后培養基質難以打散，數據未列出）。 故選擇粉碎度為20 目的燕麥進行后續實驗。

圖2 粉碎度對紅曲菌產MK 的影響Fig. 2 Effects of crushing degree on MK production by Monascus spp.

2.3 加水方式對紅曲菌產MK 的影響

在2.2 實驗結果的基礎上， 考察固體培養基的加水方式即分2次加水或1次加水對紅曲菌產MK的影響，結果如圖3 所示。

圖3 加水方式對紅曲菌產MK 的影響Fig. 3 Effects of water adding mode on MK production by Monascus spp.

由圖3 可知，加水方式對MK 產量無顯著影響（p＞0.05），其平均產量均為8 mg/g 左右。 但在固態發酵培養過程中發現，1次加水的燕麥固體培養基因結塊而不能被充分打散，這在一定程度上減少了基質內氣體交換并導致熱量積累，菌體僅在物料表面生長，原料利用率低[16]。 2 種加水方式所得MK 產量相當，主要與燕麥的糊化程度有關，即1次加水的培養基因含水質量分數較高使其糊化程度較好。故繼續考察滅菌前加水質量分數對紅曲菌產MK的影響。

2.4 滅菌前加水質量分數對紅曲菌產MK 的影響

根據滅菌后物料疏松或結塊對紅曲發酵的影響，在保證燕麥基質不結塊的前提下，探究滅菌前加水質量分數對紅曲菌產MK 的影響， 結果如圖4所示。

圖4 滅菌前加水質量分數對紅曲菌產MK 的影響Fig. 4 Effects of water addition on MK production by Monascus spp. before sterilization

由圖4 可知，在保證培養基均能被打散的前提下， 當滅菌前加水質量分數從16.67%增加至30%時， 燕麥紅曲中MK 質量分數呈現下降的趨勢，加水質量分數分別為23.33%、26.67%和30%時MK產量下降最顯著（p＜0.05）。 滅菌前燕麥固體培養基加水量過高，易造成培養基質結塊，進而影響通氧量，不利于紅曲菌的生長及MK 的產生。結合2.3 和2.4 實驗結果，分別在固體培養基滅菌前、后各加質量分數16.67%的水分進行后續實驗。

2.5 乳酸、冰乙酸添加量對紅曲菌產MK 的影響

培養基的初始pH 可影響紅曲菌生長及代謝[12]。 在2.4 實驗結果的基礎上，探究乳酸及冰乙酸的添加量對燕麥紅曲固態發酵產MK 的影響，結果如圖5 所示。

由圖5 可知，不同添加量的冰乙酸及乳酸對紅曲菌產MK 無顯著影響（p＞0.05）。 當乳酸添加量為0.6 mL/hg 時MK 的產量最高， 可達10.27 mg/g，比對照提高25.31%。 與對照相比無顯著差異，主要與實驗的平行性相對較差有關。

圖5 冰乙酸和乳酸質量濃度對紅曲菌產MK 的影響Fig. 5 Effects of acetic acid and lactic acid concentrations on MK production by Monascus spp.

此外， 分析滅菌前后固體培養基的pH 值及冰乙酸和乳酸含量的結果表明，添加冰乙酸的培養基滅菌后pH 值及冰乙酸含量均降低， 而滅菌對培養基中乳酸影響不大， 表明乳酸穩定性比冰乙酸好。大量研究表明，紅曲菌偏愛乳酸[17]，且紅曲菌生長速度相對較慢，發酵初期添加酸，利于抑制雜菌生長。故選擇添加0.6 mL/hg 乳酸進行后續實驗。

2.6 金屬離子對紅曲菌產MK 的影響

金屬離子是微生物細胞中各種酶的活性成分，在微生物生長代謝過程中具有調節并維持細胞的滲透壓、保持氧化還原電位等作用。 考察了金屬離子對燕麥紅曲固態發酵產MK 的影響， 結果如圖6所示。

圖6 金屬離子對紅曲菌產MK 的影響Fig. 6 Effects of metal ions on MK production by Monascus spp.

由圖6 可知，添加Mg2+的燕麥紅曲MK 產量最高，可達13.53 mg/g，比對照提高了26.06%。 Mg2+作為微生物生長所需的微量元素，不僅是微生物細胞的成分，也是細胞內多種酶的活性激活劑[10]。故繼續探究Mg2+的添加量對紅曲菌發酵燕麥產MK 的影響。

2.7 鎂離子添加量對紅曲菌產MK 的影響

在2.6 實驗結果基礎上， 探究Mg2+添加量對燕麥紅曲固態發酵產MK 的影響， 結果如圖7 所示。當Mg2+添加量為0.007 mol/kg 和0.017 mol/kg 時均可顯著促進紅曲菌產MK（p＜0.05），而Mg2+添加量為0.007 mol/kg 時MK 產量最大。 故選擇0.007 mol/kg為Mg2+的最適添加量。

圖7 鎂離子添加量對紅曲菌產MK 的影響Fig. 7 Effects of Mg2 + addition on MK production by Monascus spp.

2.8 大豆分離蛋白對紅曲菌產MK 的影響

本課題組前期研究結果表明，在以大米為基質的固體培養基中添加大豆分離蛋白可顯著促進紅曲菌產MK（數據未列出）。 為在相同發酵周期內獲取更高的MK 產量，在優化后的裸燕麥培養基中添加大豆分離蛋白，考察大豆分離蛋白添加量（質量分數）對紅曲菌產MK 的影響，結果如8 所示。

圖8 大豆分離蛋白添加量對紅曲菌產MK 的影響Fig. 8 Effects of soybean protein isolate on MK production by Monascus spp.

由圖8 可知， 隨著大豆分離蛋白添加量的增加，MK 的產量呈現先上升后下降的趨勢。 其中，當大豆分離蛋白添加量為2%時MK 產量比對照提高32.63%。結果表明，添加質量分數2%大豆分離蛋白可促進紅曲菌產MK， 即有望通過添加大豆分離蛋白，在較短的發酵周期獲取較高的MK 產量。

2.9 發酵時間對紅曲菌產MK 和MPs 的影響

在優化后的燕麥固體培養基基礎上，考察發酵32 d 內燕麥紅曲中MPs 及MK 含量的變化趨勢，結果如圖9 所示。

圖9 發酵時間對紅曲菌產MPs 和MK 的影響Fig. 9 Effects of fermentation time on MK and MP production by Monascus spp.

由圖9（a）可知，在發酵前17 d，MK 的產量逐漸上升，其中發酵至11 d 與2.8 中未添加大豆分離蛋白 （對照） 發酵14 d 時MK 的產量相同， 均為13.45 mg/g， 而添加大豆分離蛋白后發酵14 d 可達19.77 mg/g。 由此可知，添加大豆分離蛋白，燕麥紅曲中MK 產量達13.45 mg/g 可比未添加時的樣品縮短3 d 發酵周期。 發酵至17～23 d，MK 產量先下降后上升，但變化不顯著（p＞0.05）。發酵至26 d 時MK的產量最高，達41.85 mg/g，而后呈下降趨勢，發酵至32 d 時MK 產量為30.53 mg/g。 由圖9（b）可知，與MK 的變化趨勢類似，在發酵過程中MPs 產量呈現2次先升后降趨勢，推測紅曲菌在發酵32 d 過程中進行了二次發酵，當發酵至26 d 即MK 產量最高時，色價達到664.53 U/g。

3 結 語

作者以燕麥為固體培養基，主要探究了燕麥的預處理和含水質量分數、營養因子、微量元素對燕麥紅曲固態發酵產MK 的影響。 在優化后燕麥紅曲固體培養基中加入質量分數2%大豆分離蛋白，發酵14 d 后MK 產量可達19.77 mg/g， 發酵26 d 后MK 產量高達41.85 mg/g。該研究通過向優化后燕麥培養基中添加大豆分離蛋白，在同等發酵時間內獲得更高的MK 產量， 即達到某MK 產量所需發酵時間縮短。 結合已有文獻，Zhang 等人[18]以小米為發酵基質，以紅色紅曲菌（Monascus ruber）為實驗菌株，在優化后的發酵條件下發酵20 d，MK 的產量可達19.81 mg/g。 該產量與本研究中發酵紅曲燕麥14 d后MK 產量基本一致。盧穎[11]以燕麥為發酵基質，在優化后的工藝條件下， 發酵14 d 后MK 產量為15.00 mg/g， 該產量低于本研究中發酵14 d 后燕麥紅曲中MK 的產量。 綜上，通過優化燕麥紅曲培養基組分并添加食品級營養因子，達到在較短的發酵周期獲取MK 含量較高的燕麥紅曲。 該研究結果可為提高功能性紅曲的生產效率及燕麥精深加工提供思路和參考。