外源氧載體和前體L-谷氨酸添加策略提高Bacillus subtilis HB-1 發酵產γ-聚谷氨酸

任東雪， 陳鵬程， 鄭 璞*， 徐志南， 盧 松

（1. 江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122；2. 浙江大學 化學工程與生物工程學院，浙江 杭州310027；3. 內蒙古阜豐生物科技有限公司，內蒙古 呼和浩特010030）

γ-聚谷氨酸（γ-PGA）[1]是一種富含游離羧基的天然環保型生物高分子材料，相對分子質量一般在100～1×104左右， 是由多個D 型和L 型谷氨酸通過酰胺鍵連接而成的高分子聚合物。γ-PGA 作為一種親水性和生物相容性良好的天然聚合物， 在食品、醫藥[2-5]、化妝品、農業和工業等領域應用廣泛。 目前制備γ-PGA 的方法主要有提取法， 化學合成法和微生物發酵法等。γ-PGA 最早是從納豆中分離提取出來的，但是納豆中γ-PGA 濃度甚微，因此提取工藝十分復雜，生產成本甚高；化學制備一般是通過二聚體縮聚法將D/L 型的谷氨酸連接制備成多肽的形式，所需化學試劑較多，制備流程復雜，難以工業化。

微生物發酵法[6]具有環境污染小，天然產物純度高和反應條件溫和的優勢。 微生物將內源的或者外源的L-谷氨酸通過自身谷氨酸異構酶的作用合成D-谷氨酸，然后通過γ-PGA 合成酶將D/L 型的谷氨酸連接成多肽，并且不斷延長形成多肽，自發分泌到胞外。 目前生產γ-PGA 的菌株主要是芽孢桿菌屬[7-9]，包括L-谷氨酸外源依賴型和非L-谷氨酸依賴型菌株，非L-谷氨酸依賴型主要利用自身合成的L-谷氨酸通過γ-PGA 合成酶[10-11]聚合形成γ-PGA，但是因為其內源L-谷氨酸水平有限，嚴重限制了γ-PGA 的產量水平。 Nuttawut[12]篩選了一株非外源L-谷氨酸依賴型菌株Bacillus licheniformisTISTR 1010， 在7 L 發酵罐擴大培養得到27.5 g/L的γ-PGA；徐艷萍等[13]利用亞硝基胍和60CO 誘變地衣芽孢桿菌，產量僅有23 g/L。隨著代謝工程的發展，很多研究者關注γ-PGA 合成酶的異源表達，彭英云[14]將來源于Bacillus methylotrophicusSK19.001的γ-PGA 合成酶基因在大腸桿菌中克隆表達，以L-谷氨酸為底物獲得0.65 g/L 產物γ-PGA；Jun[15]在Bacillus amyloliquefaciens中過表達γ-PGA 合成酶基因（PgsBCA），發現γ-PGA 產量反而下降；Cao[10]在谷氨酸棒桿菌（C. glutamicum）中表達PgsBCA 基因，但是γ-PGA 產量僅有0.69 g/L；Hao 等[16]在大腸桿菌（Escherichia coliBL21）中表達γ-PGA 合成酶基因，在添加了40 g/L （NH4）2SO4的情況下，γ-PGA產量也僅有3.7 g/L。

由于非L-谷氨酸依賴型菌體和γ-PGA 合成酶異源表達所得的目的產物γ-PGA 產量低，Zhu[17]篩選出一株可以利用秸稈水解糖作為碳源的外源L-谷氨酸依賴型菌株Bacillus subtillisHB-1，在3 L發酵罐上分批發酵可獲得23.63 g/L 的γ-PGA。 但是由于發酵液的黏度較大（1900 mPa·s）[18]，極大地限制了發酵培養基的溶氧水平，阻礙了菌體的生長和產物的進一步生成，造成前體L-谷氨酸的轉化率較低，代謝副產物較多。 作者比較了幾種常見的氧載體對Bacillus subtilisHB-1 菌體生長和γ-PGA產量的影響，選用PDMS 明顯提高了菌體生長和γ-PGA 產量， 并通過前體L-谷氨酸添加時間及其添加量的單因素實驗，提高了前體L-谷氨酸的轉化效率。 同時發酵罐上放大培養，獲得了52 g/L 的目的產物γ-PGA，其相對分子質量高達1000 萬，為醫藥材料、工業農業等領域提供了高相對分子質量的天然原料，具有比較重要的應用價值。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種實驗室保存枯草芽孢桿菌HB-1（BacillussubtilisHB-1）。

1.1.2 培養基LB 液體培養基：酵母提取物5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L；pH 7.0。

LB 固體培養基：在LB 液體培養基的基礎上加入質量分數1.6%的瓊脂粉。

發酵培養基：胰蛋白胨30 g/L，玉米秸稈混合糖水解液[17]60 g/L，氯化鈉10 g/L，L-谷氨酸40 g/L，氯化鈣1 g/L，七水硫酸鎂1 g/L，一水硫酸錳0.34 g/L；pH 7.0。

1.1.3 主要儀器和設備冷凍干燥機： 購自美國Labconco 公司；SBA-40C 生物傳感分析儀： 購自山東省科學院生物研究所；氨基酸分析儀：購自美國安捷倫公司；凝膠過濾色譜儀：購自美國沃特世公司。

1.1.4 主要試劑聚二甲氧基硅烷（PDMS）、正庚烷，購自麥克林生物科技有限公司；1-氟-2，4-二硝基苯基-5-L-丙氨酸酰胺 （FDAA）， 購自Sigma 公司；醋酸鈉、三乙胺、四氫呋喃、甲醇、乙腈（分析純），購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子培養取10 ～20 μL 甘油管保存的Bacillus subtilis HB-1， 接種30 mL LB 液體培養基中，37 ℃、110 r/min 培養12 h， 取菌液稀釋涂布于LB 固體培養基平板，37 ℃培養箱孵育12 h 左右，挑取單菌落，置于LB 液體培養基，用于下一步培養和發酵實驗。

1.2.2 氧載體添加量的確定按照1.2.1 種子培養的方法培養種子至對數期，按照10%的接種體積分數將生長到對數期的種子液接種于發酵培養基，分別添加體積分數0、0.5%、1%、3%、5%、10%的正庚烷和體積分數0、1%、5%、10%、15%、20%的聚二甲氧基硅烷（PDMS），37 ℃、110 r/min 培養48 h，收集發酵液用于測定OD600和γ-PGA 產量。

1.2.3 氧載體添加時間的確定按照1.2.1 種子培養的方法培養種子至對數期，按照10%的接種體積分數將生長到對數期的種子液置于發酵培養基，設置不同的時間梯度（0、6、12、18、24、30、36 h）添加體積分數10%的氧載體 （PDMS），37 ℃，110 r/min 培養48 h， 收集發酵液用于測定OD600和γ-PGA產量。

1.2.4 前體L-谷氨酸的添加時間的確定按照1.2.1 種子培養的方法培養種子至對數期，按照10%的接種體積分數將生長到對數期的種子液置于發酵培養基， 設置不同的時間梯度（0、6、12、18、24、30、36 h） 添加終質量濃度為5 g/L 的前體L-谷氨酸，37 ℃、110 r/min 培養48 h， 收集發酵液用于測定OD600和γ-PGA 產量。

1.2.5 前體L-谷氨酸添加量的確定按照1.2.1 種子培養的方法培養種子至對數期，按照10%的接種體積分數將生長到對數期的種子液置于發酵培養基， 分別添加終質量濃度為0、5、10、15、20、30 g/L的前體L-谷氨酸，37 ℃、110 r/min 培養48 h， 收集發酵液用于測定OD600和γ-PGA 產量。

1.2.6 發酵罐培養3 L 發酵罐， 裝液量1.5 L，氧載體PDMS 添加體積分數為10%， 種子液OD600為6.0 左右時，按照體積分數為5%的接種量接入發酵罐，溫度自控為37 ℃，通氣量1～2 vvm，攪拌轉速400～1000 r/min 維持溶氧水平在體積分數20%以上， 體積分數10%氨水和2 mol/L 鹽酸控制發酵過程pH 穩定在7.0。 在一次性補料中，在發酵25 h 一次性向培養基中添加終質量濃度為10 g/L 的前體L-谷氨酸；在流加發酵中，當葡萄糖質量濃度低于5 g/L 時， 使用蠕動泵按照15～20 mL/h 的流速將200 g/L 的玉米秸稈混合糖溶液[17]注入發酵罐，維持罐中質量濃度在5～10 g/L 范圍內； 當前體L-谷氨酸質量濃度低于10 g/L 時， 使用蠕動泵按照20～30 mL/h 的流量添加300 g/L 的前體L-谷氨酸，維持其質量濃度在10 g/L。 間隔3～5 h，取10 mL 發酵液，測定OD600，前體L-谷氨酸、葡萄糖、木糖及其產物γ-PGA 質量濃度。

1.3 分析方法

1.3.1 生物量檢測以去離子水為空白對照，利用可見光分光分度計在波長為600 nm 處檢測培養液的吸光值OD600，表示生物量。

1.3.2 葡萄糖以及前體L-谷氨酸的檢測用蒸餾水將離心后的發酵上清液稀釋100 倍后， 取25 μL稀釋后的樣品液注入SBA-40C 測量剩余葡萄糖和剩余前體L-谷氨酸的量。

1.3.3 γ-PGA 產量測定取5 mL 發酵液12000 r/min離心30 min 除去菌體， 加入15 mL 乙醇沉淀，4 ℃沉淀12 h 左右，12000 r/min 離心30 min 除去雜質，沉淀置于60 ℃真空干燥箱烘干稱質量，為粗略計算的γ-PGA 產量。取水解管，稱取100.0 mg 左右固體發酵產物γ-PGA，加8 mL 6 mol/L 鹽酸，充氮氣3 min，調流量，使溶液呈微沸狀態，擰緊水解管蓋。放入已設定為120 ℃的烘箱中，水解22 h。2 mol/L NaOH 中和后濾紙過濾，15000 r/min 離心30 min，取400 μL 上清液用于D/L 谷氨酸衍生化。

D/L 谷氨酸衍生化方法[19]：取10 μL 上述制備的γ-PGA 酸水解上清液， 加入8 μL 的1 mol/L 的NaHCO3和40 μL 1-氟-2，4-二硝基苯基-5-L-丙氨酸酰胺（FDAA）丙酮溶液（10 mg/mL）于1.5 mL 的離心管中，40 ℃水浴鍋加熱1 h，加熱結束后冷卻至室溫，加入8 μL 1 mol/L 的鹽酸，最后加入934 μL體積比為40∶60 的乙腈和水混合液， 混勻后過有機濾膜。 色譜柱：Develosil ODS-UG-5 （150 mm×4.6 mm），流動相A：水（含體積分數為0.05%的三氟乙酸），流動相B：乙腈（含體積分數為0.05%的三氟乙酸），流速：1.0 mL/min，檢測波長：340 nm，柱溫：40℃，進樣量：20 μL，洗脫程序：0 min：流動相B 的體積分數為20%，40 min： 流動相B 的體積分數為40%，45 min：流動相B 的體積分數為50%。

1.3.4 γ-PGA 提取純化取50 mL 發酵液12000 r/min 離心30 min 除去菌體，加入150 mL 無水乙醇反復沉淀3～5次，12000 r/min 離心30 min 去除上清液，取沉淀下來的γ-PGA 溶于50 mL 無菌水中，置于透析袋，放入2 L 蒸餾水中透析3～5 d，去除雜質和小相對分子質量的γ-PGA， 將透析袋內的γ-PGA 水溶液冷凍干燥，得到白色γ-PGA 純品。

1.3.5 傅立葉變換紅外光譜 （FTIR）干燥成粉末狀的發酵產物采用傅立葉變換紅外光譜進行檢測其特定吸收峰，掃描波長為4500～500 cm-1。

1.3.6 氨基酸分析儀測定發酵產物中氨基酸組分酸水解后的發酵產物使用氨基酸分析儀檢測單體氨基酸組成。色譜柱：Agilent Hypersil ODS（4.0 mm×250 mm）， 流動相A：27.6 mmol/L 醋酸鈉-三乙胺-四氫呋喃（體積比為500∶0.11∶2.5）， 流動相B：80.9 mmol/L 醋酸鈉-甲醇-乙腈（體積比為1∶2∶2），流速：1.0 mL/min，檢測器波長：338 nm，柱溫：40 ℃，進樣量：20 μL，洗脫程序：0 min：流動相B 的體積分數為8%；17 min： 流動相B 的體積分數為50%；20 min：流動相B 的體積分數為100%；24 min：流動相B 的體積分數為0%。

1.3.7 γ-PGA 相對分子質量測定凝膠過濾色譜法（Gel filtration chromatography，GFC）[20]測 定γ-PGA 相 對 分 子 質 量， 色 譜 柱：UltrahydrogelTMLinear（300 mm×7.8 mm），流動相：0.1 mol/L NaNO3，流速：1.0 mL/min，柱溫：45 ℃，進樣量：20 μL。

2 結果與討論

2.1 氧載體的選擇

氧氣在好氧發酵中起著重要的作用，特別是對于高黏度的聚合物生產中。 γ-PGA 黏度大，在發酵過程中嚴重影響了菌體的正常生長和γ-PGA 產量的進一步提高。 一種獲得更好的氧供應的方法是通過添加氧載體來增加氧在培養基中的溶解度。 氧載體一般為疏水性液體， 其中氧的溶解度比水高15～20 倍，可以大幅度提高空氣中的氧氣在液體培養基中的溶解度，供給菌體生長和代謝充足的氧氣。 有報道表明，正十二烷被添加到培養基中，改善了透明質酸（HA）、多糖、二十二碳六烯酸、番茄紅素、β-胡蘿卜素等的生產[21]。 因此作者選擇正己烷、正庚烷、正十二烷、正十六烷和PDMS 等5 種氧載體添加到發酵培養基中，發現5 種氧載體都明顯提高了菌體的生長（圖1），其中PDMS、正十二烷和正十六烷最為明顯，但后兩者卻降低了γ-PGA 的產量，而正庚烷和PDMS 能夠有效提高γ-PGA 的產量。 因此選用正庚烷和PDMS 作為氧載體，研究其體積分數對生物量和γ-PGA 產量的影響。

圖1 不同氧載體對菌體生長和γ-PGA 產量的影響Fig. 1 Effect of different oxygen carriers on cell growth and γ-PGA production

2.2 正庚烷和PMDS 添加量對生物量和γ-PGA產量的影響

Zhang 等[22]報道氧載體正庚烷的添加使得細胞的NADH/NAD+比例升高，糖酵解（EMP）和三羧酸循環（TCA）的碳代謝流量增加，從而提高了γ-PGA的產量。 因此本研究中推測氧載體可以提供EMP、TCA 循環中需要ATP 的酶和γ-PGA 合成酶足夠的氧氣，促進了菌體生長和γ-PGA 的產生。 本研究在發酵培養基中初始添加體積分數為1%的正庚烷，發現菌體量明顯提高，γ-PGA 產量也由原來的23 g/L 提高到28 g/L（圖2 （a）），但是過量的正庚烷對菌體毒害作用明顯，使得菌體OD600明顯下降，體積分數為10%的正庚烷使得菌體完全不能生長，因此正庚烷對菌體的毒性限制了其應用。 PDMS 作為一種無毒無害的聚合物， 在發酵培養基中添加PDMS，發現隨著PDMS 添加量的增加，菌體生長速率明顯提高， 產物質量濃度隨著菌體的生長而增加。 添加體積分數10%～20%左右的PDMS 后，菌體生長較原來提高了3～5 倍，γ-PGA 產量能達到32 g/L，較對照組提高了39%（圖2（b））。

圖2 正庚烷和PDMS 添加量對菌體生長和γ-PGA 產量的影響Fig. 2 Effects of the addition of n-heptane and PDMS on cell growth and γ-PGA production

2.3 正庚烷和PDMS 添加時間對生物量和γ-PGA 產量的影響

進一步考察了氧載體在菌株前期、中期和后期添加對菌體生長和產γ-PGA 的影響。 如圖3 所示，無論是正庚烷還是PDMS， 都是在發酵前期添加利于菌體生長和γ-PGA 的產生， 推測其原因可能在于Bacillus subtilis HB-1 產γ-PGA 屬于生長偶聯型， 菌體快速生長的同時才能產生更多的目的產物，一旦菌體生長受到限制，就會引起產物γ-PGA合成的相關酶的酶活降低，進而降低前體L-谷氨酸的轉化率，降低了產物γ-PGA 的質量濃度。 通過比較γ-PGA 產量， 發現正庚烷和PDMS 最適添加時間均為0 h，鑒于正庚烷的細胞毒性，最終選擇在初始發酵培養基中添加體積分數10% PDMS 來提高γ-PGA 產量。

圖3 正庚烷和PDMS 添加時間對菌體生長和γ-PGA 產量的影響Fig. 3 Effects of the addition time of n-heptane and PDMS on cell growth and γ-PGA production

2.4 前體L-谷氨酸添加時間和添加量的確定

作為L-谷氨酸依賴型的菌株， 前體L-谷氨酸的添加是決定γ-PGA 產量的重要的因素之一，前期實驗發現原始培養基添加少量的前體L-谷氨酸不能滿足菌體合成大量的γ-PGA，而培養基中直接添加過量的前體L-谷氨酸會使得菌體將其作為碳源利用而造成前體L-谷氨酸的浪費難以高效合成產物γ-PGA。因此選擇在菌體生長對數期及穩定期前后一次性添加一定量前體L-谷氨酸（終質量濃度為5 g/L）。 如圖4（a），在發酵18 h 添加時，γ-PGA產量較高，約為34 g/L，比對照組產量提高了30%，前體L-谷氨酸的轉化率為75%，相比對照組提高了15%。推測γ-PGA 合成酶的活性與菌體生長密切相關，在對數生長期間菌體γ-PGA 合成酶酶活較高，在此期間加入前體L-谷氨酸，可以促進其高效轉化為產物γ-PGA，待菌體生長到穩定期后，γ-PGA 合成酶酶活降低， 導致前體L-谷氨酸利用率降低，產物質量濃度降低。 同時，合適的前體L-谷氨酸添加質量濃度對產物產量也很重要，圖4（b）顯示，添加終質量濃度為10 g/L 的前體L-谷氨酸得到了43 g/L的產物，前體L-谷氨酸轉化率提高到86%。

圖4 前體L-谷氨酸添加時間和添加質量濃度對菌體生長和γ-PGA 產量的影響Fig. 4 Effects of precursor L-glutamic acid addition time and addition amount on cell growth and γ-PGA production

2.5 3 L 發酵罐分批發酵

在添加了體積分數為10%的氧載體PDMS 的基礎上，進行3 L 發酵罐發酵。 從圖5（b）可以看出發酵初期菌體生長迅速，在20 h 左右OD600達到55以上，生物量比沒有添加氧載體的對照（圖5（a））提高了1.2 倍， 菌體快速生長的同時伴隨葡萄糖、木糖、 前體L-谷氨酸的快速消耗和產物γ-PGA 的同步生成，說明菌體生長和產γ-PGA 是同步進行的。氧載體的添加促進菌體生長的同時也促進了前體L-谷氨酸的轉化， 對照組40 g/L 的前體L-谷氨酸最終得到26 g/L 的γ-PGA， 前體L-谷氨酸轉化率為65%；而添加了體積分數10% PDMS 后，得到35 g/L 的γ-PGA，轉化率提高到87.5%。說明氧載體的添加有效提高了前體L-谷氨酸的轉化率，從而提高了γ-PGA 的產量。

圖5 3 L 發酵罐批次發酵曲線對照添加體積分數10%PDMSFig. 5 Batch fermentation curves of control and 10%PDMS in 3 L fermentation tank

2.6 3 L 發酵罐一次性補加前體谷氨酸發酵

前體L-谷氨酸供應不足也可能會造成產物γ-PGA 的產量無法進一步提高， 在發酵過程中，25 h左右前體L-谷氨酸開始大量消耗，質量濃度降低到20 g/L，此時添加終質量濃度為10 g/L 的前體L-谷氨酸，菌體開始大量利用其產生γ-PGA，最終獲得了45 g/L 的γ-PGA， 前體L-谷氨酸的轉化率進一步提高到90%（圖6）。

2.7 3 L 發酵罐流加碳源和前體谷氨酸發酵

在發酵過程中，碳源是菌體生長的主要因素[23]，枯草芽孢桿菌HB-1 生長和發酵產γ-PGA 是同步進行的，因此如果碳源消耗殆盡，菌體不再生長，那么即使有充足的前體L-谷氨酸，γ-PGA 合成酶的合成能力也有限。 故采用流加碳源的方式以滿足菌體的能量供應，同時流加前體L-谷氨酸使得菌體大量合成γ-PGA。 結果如圖7 所示，維持碳源質量濃度在5 g/L 上下， 維持前體L-谷氨酸在10 g/L 左右，在發酵50 h 后產物γ-PGA 高達52 g/L，較單純補加前體L-谷氨酸提高了15%，比搖瓶發酵提高了1 倍左右。

圖6 枯草芽孢桿菌HB-1 一次性補加前體L-谷氨酸發酵曲線（體積分數10% PDMS）Fig. 6 Fermentation curve of Bacillus subtilis HB-1 with one -time supplement of precursor L -glutamate（10% PDMS）

圖7 枯草芽孢桿菌HB-1 流加碳源和前體L-谷氨酸發酵曲線（體積分數10% PDMS）Fig. 7 Fed-batch fermentation curve of Bacillus subtilis HB-1 （10% PDMS）

2.8 發酵產物的提取與鑒定

2.8.1 發酵產物的提取發酵獲得的混合液離心去除菌體，根據γ-PGA 不溶于乙醇的性質，采用3倍體積的乙醇沉淀目的產物， 將其烘干后得到圖8（a）所示的黃色粗品，之后將其重新溶于蒸餾水中，采用透析的方法除去粗品中的小分子雜質，將透析得到的產物冷凍干燥得到白色的純品γ-PGA（圖8（b）），采用酸水解的方法測定產物中D/L 谷氨酸的含量，確定γ-PGA 的純度為96%（質量分數）。

圖8 提取的發酵產物樣品Fig. 8 Extracted crude and pure fermentation products

2.8.2 發酵產物的紅外圖譜傅立葉紅外光譜可以根據吸收峰的位置和強度判斷未知化合物的化學基團，從而確定其分子結構。 圖9 為發酵純化的產物在4000 ～500 cm-1的傅立葉紅外光譜圖，3374.87 cm-1處吸收峰為N－H 對稱伸縮振動帶； 2919.75 cm-1為－CH2的伸縮振動吸收峰；1592.06 cm-1處吸收峰為酰胺中－C＝O 伸縮振動帶（酰胺吸收帶I）；1402.95 cm-1處吸收峰為酰胺中N－H 彎曲振動和C－N 伸縮振動的耦合（酰胺吸收帶II）； 1259.82 cm-1為C－N 伸縮振動（酰胺吸收帶III）， 以上特征峰的存在表明產物為聚酰胺類化合物。

圖9 發酵產物的紅外光譜圖Fig. 9 Infrared spectrum of the fermentation product

2.8.3 發酵產物酸水解混合液分析鑒定采用酸水解的方法分解發酵產物，采用氨基酸分析儀測定目的產物的氨基酸組成，結構如圖10 所示，發酵產物的單體組成全部是D/L 谷氨酸，無其他氨基酸組分，D/L 谷氨酸衍生化后， 測定D/L 谷氨酸的比例，結果表明發酵產物D/L 配比為1∶3（圖11）。 結合紅外光譜的結果，證明發酵產物為D/L 谷氨酸通過酰胺鍵連接而成的多肽類化合物。

圖10 氨基酸分析儀測定發酵產物的氨基酸組分Fig. 10 Determination of the amino acid composition of the fermentation product by an amino acid analyzer

圖11 谷氨酸衍生化法測定發酵產物的D/L 谷氨酸比例Fig. 11 Determination of D/L glutamic acid ratio of fermentation products by glutamic acid derivatization

2.8.4 產物相對分子質量的測定采用凝膠過濾色譜法測定發酵產物的相對分子質量，得到不同相對分子質量的峰吸收，主要峰為peak Ⅰ，相對分子質量為1000 萬左右， 目前沒有報道其他微生物發酵制備如此高相對分子質量的γ-PGA，此外還存在一些小峰，但是含量較低，說明γ-PGA 在前體L-谷氨酸在發酵過程中逐步合成低相對分子質量的短鏈γ-PGA，在發酵過程中不斷延長，最終得到高達1000 萬的γ-PGA，見圖12。

圖12 γ-PGA 相對分子質量的測定Fig. 12 Molecular weight of γ-PGA

3 結 語

作者采用在發酵過程中添加氧載體（PDMS）和前體L-谷氨酸來提高Bacillus subtilis HB-1 產γ-PGA 的能力，在搖瓶發酵實驗中，在發酵培養基中添加體積分數10%的PDMS， 使得菌體生物量提高了3～5 倍，γ-PGA 產量提高了39%；在菌體生長對數期添加終質量濃度為10 g/L 的前體L-谷氨酸，γ-PGA 產量達到43 g/L，前體L-谷氨酸轉化率達到86%。 在3 L 發酵罐上控制流加碳源和前體L-谷氨酸的質量濃度，γ-PGA 產量最終達到52 g/L，較原始提高了1 倍。 發酵產物經紅外，氨基酸分析儀測定為D/L 谷氨酸經過酰胺鍵連接成的多肽類化合物，產物γ-PGA 中D/L 谷氨酸比例為1∶3，相對分子質量高達1000 萬。