即食海蜇菌群分析與腐敗菌種分離和鑒定

林以琳， 林 瑜， 繆 松， 曾紹校， 林少玲*

（1. 福建農(nóng)林大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州350002；2. 愛爾蘭農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)與食品發(fā)展局TEAGASC 食品研究中心，都柏林 科克R93XE12）

即食海蜇是一種水分含量高、低脂肪且營養(yǎng)豐富，具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)功能的食品[1]。 海蜇含有人體需要的多種營養(yǎng)成分，尤其含有人們飲食中所缺的碘，是一種重要的營養(yǎng)食品。 海蜇最主要的成分是膠原蛋白， 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化、抗疲勞和免疫調(diào)節(jié)功能，對治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有一定的效果[2-3]。 海蜇多肽可應(yīng)用于抗氧化、降血脂、降血壓等藥物的開發(fā)[4-5]。 此外，據(jù)文獻(xiàn)記載，海蜇對慢性氣管炎、風(fēng)濕、高血壓等多種病癥具有良好的療效，已成為一種具有較高食用、營養(yǎng)及藥用價(jià)值的名貴海洋食品。

新鮮海蜇含水量高，易分解和自溶，因此在加工過程中需要添加大量的食鹽和明礬使其迅速脫水，收斂和凝固蛋白質(zhì)[6]。 加入明礬可顯著提高海蜇的貯藏品質(zhì)，但同時(shí)也帶來海蜇鋁殘留量過高的問題。 而人體中鋁含量過高，則會(huì)對神經(jīng)、骨骼及免疫具有潛在的毒性[7]。 即食海蜇制品通常是三礬鹽漬海蜇經(jīng)過清洗、切割、滅菌、包裝等一系列加工處理后得到的即食食品。 即食海蜇生產(chǎn)加工中脫鋁技術(shù)的應(yīng)用，不僅降低了鋁離子對人體的危害[8]還有效避免了微生物的生長。 根據(jù)我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布的NYT 1515-2007《綠色食品海蜇及制品》[9]，除了不得檢出沙門氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌等致病菌外，大腸菌群和菌落總數(shù)也不得超標(biāo)。 隨著即食海蜇產(chǎn)品明礬含量及鋁殘留量的降低，湛江市場對軟包裝即食海蜇絲制品細(xì)菌學(xué)品質(zhì)進(jìn)行了分析，并對產(chǎn)品中殘存細(xì)菌的安全性進(jìn)行了評(píng)價(jià)[10]。 結(jié)果表明：即食海蜇產(chǎn)品大腸菌群數(shù)均為30 MPN/hg，革蘭氏陰性桿菌（88.9%）、少量的革蘭氏陽性無芽孢球菌（8.3%）、極少量的革蘭氏陽性有芽孢桿菌（2.8%）。 對即食海蜇的微生物指標(biāo)問題進(jìn)行長期監(jiān)控及有效控制， 是當(dāng)前要解決的問題之一。 明確即食海蜇腐敗變質(zhì)的微生物種類，并針對性尋找有效的抑菌方法，有效提高即食海蜇的食用安全性及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

作者通過對即食海蜇產(chǎn)品進(jìn)行菌群分析，并對腐敗優(yōu)勢菌種進(jìn)行分離、 純化和16S rDNA 的PCR擴(kuò)增與序列測定后經(jīng)過BLAST 分析，明確腐敗優(yōu)勢菌種類。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

即食海蜇：由福州永輝超市購得不同廠家生產(chǎn)的5 類即食海蜇產(chǎn)品；平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、 細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒：Solarbio 公 司 產(chǎn) 品；DreamTaq-TM DNA 聚 合 酶（EP0702）：MBI 公司產(chǎn)品；SanPrep 柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒：上海生工生物工程股份有限公司產(chǎn)品；pMD?18-T Vector 連接試劑盒：Takara 公司產(chǎn)品。

PL202-S100 型精密分析天平：Mettler Toledo（上海） 儀器有限公司產(chǎn)品；HPX-9000 型數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱： 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠制造；2720 thermal cycler 型PCR 儀：Applied Biosystems公司產(chǎn)品；T6 新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)： 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；MR6 數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市雙捷實(shí)驗(yàn)儀器廠制造；101-0 型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海陽光實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 即食海蜇樣品中微生物污染狀況各取10 g即食海蜇樣品，放入含有90 mL 無菌稀釋液的無菌均質(zhì)袋內(nèi)，于8000 r/min 均質(zhì)2 min，制成1∶10（體積比）樣品勻液。 取1 mL 樣品勻漿，以1∶10（體積比）進(jìn)行梯度稀釋，全過程控制在15 min 內(nèi)。以稀釋后的即食海蜇樣品為原料， 進(jìn)行各種微生物的測定，測定方法如表1。

1.2.2 腐敗優(yōu)勢菌種分離純化各取1 mL 制得的稀釋樣品加入無菌錐形瓶中置于30 ℃搖床培養(yǎng)。取1 mL 培養(yǎng)后的菌液，以1∶10（體積比）進(jìn)行梯度稀釋，得到10-2、10-3、10-4稀釋樣品。 移取稀釋樣品各100 μL，涂布于PCA 培養(yǎng)基中，倒置于30 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。 取出平板，挑取菌落，轉(zhuǎn)接到新的固體培養(yǎng)基，采用三線劃線法接種培養(yǎng)至分離到純種菌落，重復(fù)純化步驟5次。 挑取純種菌落， 溶于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng)，30 ℃培養(yǎng)24 h， 取1 mL 培養(yǎng)后菌液與體積分?jǐn)?shù)50%滅菌后甘油1∶1（體積比）混合均勻，于-80 ℃超低溫冰箱保藏。

表1 幾種即食海蜇中常見微生物的測定方法Table 1 Methods for the determination of common microorganisms in ready-to-eat jellyfish

1.2.3 腐敗優(yōu)勢菌種16S rDNA 序列鑒定根據(jù)細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒抽提腐敗優(yōu)勢菌的DNA，并于-20 ℃冰箱凍存。

1.2.416S rDNA 的PCR 擴(kuò)增與序列測定取抽提得到的腐敗優(yōu)勢菌DNA 進(jìn)行16S rDNA 的PCR 擴(kuò)增， 其中正向引物為7F：5'-CAGAGTTTGATCCTG G-CT-3'， 反向引物為1540R：5'-AGGAGGTGATC CAGCCGCA-3'。PCR 循環(huán)設(shè)置：98 ℃預(yù)變性3 min；30個(gè)循環(huán)：98 ℃變性25 s，55 ℃復(fù)性25 s，72 ℃延伸1 min； 最后72 ℃溫浴10 min，4 ℃30 min 終止反應(yīng)。 通過瓊脂糖凝膠電泳提取DNA 片段，送至上海生工技術(shù)公司進(jìn)行測序。

1.2.5 序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建利用BLAST 對所得腐敗優(yōu)勢菌的16S rDNA 序列進(jìn)行相似性對比分析， 并使用Bootstrap 及Neighbour Joining 計(jì)算進(jìn)化距離，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 即食海蜇樣品中微生物污染狀況

表2 即食海蜇細(xì)菌學(xué)品質(zhì)指標(biāo)Table 2 Bacterial standards of ready-to-eat jellyfish

如表2 所示， 即食海蜇樣品中菌落總數(shù)為48000 CFU/g， 遠(yuǎn)高于國家標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的不得高于30000 CFU/g，說明該產(chǎn)品被微生物污染。 同時(shí)，樣品中并未檢出大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌，說明該產(chǎn)品在加工處理中受致病菌污染的可能性小，但總體上不符合即食海蜇產(chǎn)品的微生物限量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

2.2 16S rDNA 序列分析鑒定

2.2.116S rDNA 的PCR 擴(kuò)增與序列測定提取經(jīng)分離純化后的2 菌株基因組DNA， 以其16S rDNA為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（圖1）。 結(jié)果表明2 條目標(biāo)條帶約為1.35 kb。將菌株的陽性質(zhì)粒送至上海生工生物公司測序，測得16S rDNA 大部分序列分別為1348 bp 和1336 bp（圖2）。

圖1 PCR 擴(kuò)增16S rDNA 基因Fig. 1 PCR amplification of 16S rDNA gene

2.2.2 BLAST 同源性搜索與系統(tǒng)發(fā)育樹的繪制菌株1 和菌株2 的16S rDNA 的序列分別經(jīng)過BLAST 分析后，Burkholderia屬的細(xì)菌與菌株1 與菌 株2 的16S rDNA 相 似 度 高 （表3）， 其 中Burkholderia lata和Burkholderia cenocepacia分 別與菌1、菌2 序列相似度達(dá)到99%和100%，因此菌株1 種屬初步鑒定為Burkholderia lata、 菌株2 為Burkholderia cenocepacia。

圖2 菌株的16S rDNA 堿基序列Fig. 2 Sequence of 16S rDNA of the strain

表3 菌株16S rDNA 序列同GeneBank 中細(xì)菌菌株同源性比較Table 3 Comparison of 16S rDNA sequence with the bacterial strain homology in GeneBank

將腐敗優(yōu)勢菌的16S rRNA 基因序列與從Genebank 中選擇的10 株菌進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，得到如圖3 所示的系統(tǒng)發(fā)育樹。 如圖所示，菌株1 與Burkholderia latastrain FL-1-2-30-S1-D0、 菌株2與Burkholderia cenocepaciastrain 的分支的序列一致性達(dá)到95%，表明它們親緣關(guān)系最近，進(jìn)一步驗(yàn)證了鑒定結(jié)果。

3 結(jié) 語

即食海蜇食用方便，但保藏時(shí)間短。 在貯藏過程中容易受到環(huán)境中溫度、pH 以及產(chǎn)品包裝等方面的影響[16，19]，這些柵欄因子有助于即食海蜇中微生物的生長[20]。 已有報(bào)道，通過PCR 技術(shù)快速檢測出海蜇中的腐敗菌有芽孢桿菌、假單胞菌以及腐敗希瓦氏菌[17-18]。 本文作者通過即食海蜇樣品的菌群分析，并未檢出大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌；但通過菌落總數(shù)分析法得知即食海蜇出廠3個(gè)月，其菌落總數(shù)（48000 CFU/g）已超出海蜇相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定（30000 CFU/g），但樣品中說明該產(chǎn)品仍然被微生物污染， 菌落總數(shù)超標(biāo)。菌落總數(shù)的快速增長嚴(yán)重影響即食海蜇的食用安全。 因此，明確腐敗優(yōu)勢菌種是十分緊急且必要的。通過對腐敗優(yōu)勢菌種進(jìn)行16S rDNA 的PCR 擴(kuò)增與序列測定后經(jīng)過BLAST 分析，發(fā)現(xiàn)腐敗優(yōu)勢菌群為革蘭氏陰性菌并主要為Burkholderia菌屬。Burkholderia菌屬隸屬于假單胞菌屬，是富有運(yùn)動(dòng)性及好氧性，呈現(xiàn)棒狀的革蘭氏陰性菌。Burkholderia在可作為生物降解、生物控制及促進(jìn)植物生長的主要微生物， 對人類免疫可造成潛在危害。 并且Burkholderia具有對抗生素的抗藥性及高運(yùn)動(dòng)性，對于人類有較大的威脅。 所以，選擇合適滅菌技術(shù)，有效抑制Burkholderia的生長， 從而對即食海蜇進(jìn)行減菌處理具有十分重要的科學(xué)意義。

圖3 菌株1 與菌株2 和相關(guān)菌株16S rDNA 基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹圖Fig. 3 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene sequence of strains 1，2 and related strains