阿魏酸對熏馬腸發酵過程中組胺及產組胺微生物的影響

趙利利， 薛林林， 李彬彬， 蔣艾廷， 盧士玲

（石河子大學 食品學院，新疆 石河子832003）

熏馬腸是新疆哈薩克民族特色的傳統肉類制品，深受大眾喜愛。 據相關資料報道，新疆伊犁地區哈薩克族群眾食管癌的發病率是全國平均水平的2.3 倍， 其中熏馬腸中生物胺含量過高可能是引起食管癌的一個重要原因[1]。 組胺是毒性較強的一種生物胺，正常條件下，食品中外源性攝入的組胺在組胺氧化酶的作用下會被迅速降解，但每當降解過程受到干擾，或者組胺量過高，食物中存在的組胺可導致組胺中毒或不耐受的情況[2]。 中毒癥狀通常表現為頭痛、心跳呼吸加快、血壓下降等[3]。 組胺是游離組氨酸在微生物的組氨酸脫羧酶作用下，發生脫羧反應產生的[4]。 許多因素可能會影響熏馬腸中組胺的產生，如食品的理化特性（即pH 值和AW）、原料質量、生產過程、產組胺微生物的存在以及游離組氨酸的可用性[2]。 在香腸的生產、貯藏和銷售過程中均會有組胺的積累[5-6]。

目前許多研究指出，天然植物提取物對組胺具有較好的抑制效果[7]。 在肉制品中，多酚類化合物已被證明對組胺的形成有很好的抑制作用[6，8]。 阿魏酸是酚類化合物的一種，存在于水果、糧食、蔬菜、中藥中，其中，谷物麩皮中含量最高[9-10]，據報道，它具有多種生理功能，對多種疾病，包括癌癥、糖尿病、心血管和神經性疾病都有廣泛的治療作用[11]。 隨著世界范圍內非傳染性慢性疾病患病率的增加，既能夠改善食品品質，又具有特殊功能的天然食品添加劑將具有更加廣闊的發展和應用前景[12]。 阿魏酸在日本被正式批準為食品添加劑， 可以加入餅干、熟食，主要用作食品抗氧化劑提高食品質量。 魏延玲在阿魏酸對風干鱸魚中N-亞硝胺及生物胺的抑制作用的研究中發現阿魏酸對組胺有很好的抑制作用，使用阿魏酸能顯著抑制風干鱸魚加工及貯藏過程中微生物的生長（P＜0.05）[13]。 而關于阿魏酸能否抑制熏馬腸中組胺和產組胺微生物的研究還未見報道。 此外， 傳統的變性梯度凝膠電泳 （PCRDGGE） 方法通常用于檢測整個體系中微生物的動態變化， 而不能區分產組胺和不產組胺的微生物。本研究用帶GC 夾的產組胺微生物特異性引物結合PCR-DGGE 檢測方法，監測阿魏酸對熏馬腸發酵過程中產組胺微生物的影響作用，為一些復雜的發酵食品（如奶酪）中產組胺微生物的鑒定提供一種快速簡便的方法。

作者以新鮮馬肉為原料，參考張雅晴[14]熏馬腸加工工藝，并通過添加不同質量濃度阿魏酸，探討阿魏酸添加量（質量分數）對組胺質量分數、游離組氨酸質量分數、微生物數、產組胺微生物等方面的影響，旨在利用阿魏酸對熏馬腸中組胺的作用效果進行研究，為將阿魏酸應用于熏馬腸及其他發酵香腸提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑阿魏酸 （純度98%）、 組氨酸（純度99%）：北京博奧拓科技有限公司產品；甲醇、乙腈（均為色譜純）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司產品；組胺（純度97%）、丹磺酰氯（純度99%）：美國Sigma 公司產品；MRS、MSA、VRBGA 和假單胞菌屬選擇性培養基： 北京奧博星生物試劑公司產品；三乙胺：石家莊世紀隆鑫商貿有限公司產品；異硫氰酸苯酯（純度99%）：上海澤崇醫藥科技有限公司產品；馬肉：購自伊犁牧民家庭；動物腸衣、煙熏液：市售。

1.1.2 儀器與設備LDZX-40 立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠制造；LC-2010AHT 高效液相色譜儀： 日本島津公司產品； 色譜柱（Ecilpse XDB-C184.6 mm×250 mm，5 μm）： 上海泰坦科技股份有限公司產品；ZXRD-7080 全自動新型鼓風干燥箱：上海一恒科技有限公司產品；ZHWY-1111 落地普通型大容量恒溫培養振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司產品；循環水式多用真空泵：鄭州長城科工貿有限公司產品；DNP-9272 恒溫培養箱：上海精宏有限公司產品；KQ-250B 型超聲波清洗器： 江蘇同君儀器科技有限公司產品；EPED-20TJ實驗室超純水器：南京易普易達科技發展有限公司產品；UB-7pH 計： 美國賽多利斯丹佛公司產品；PCR 儀: 美國BIO-RAD 公司產品；DGGE 儀： 美國BIO-RAD 公司產品；水平電泳儀：北京市六一儀器廠制造；凝膠成像儀：美國BIO-RAD 公司產品。

1.2 方法

1.2.1 新疆熏馬腸的制作工藝

1） 工藝配方 （質量分數） 瘦肉80%， 肥肉20%，白糖2%，食鹽2.5%，姜粉0.2%，胡椒粉0.1%，八角0.1%，花椒粉0.15%，味精0.1%，五香粉0.1%，亞硝酸鈉0.01%，煙熏液1%。

2） 加工工藝 原料肉處理 （紫外燈照射30 min）→修整、切丁（切小拇指上指尖大小）→配料→腌制 （4 ℃，1 d）→接種→灌腸→發酵 （18 ℃，RH90%～95%，2 d）→成熟（12 ℃，RH70%～75%，25 d）→成品。 分別在第0、3、7、14、28 天取樣，對微生物數量、水分含量、pH 測定，置于-20 ℃冷凍保藏，以備組胺和組氨酸的測定。

1.2.2 試驗設計將腌制好的原料肉均勻地分為4組， 分別做如下處理： 第I 組添加0 mg/kg 的阿魏酸；第II 組添加100 mg/kg 的阿魏酸；第III 組添加300 mg/kg 的阿魏酸；第Ⅳ組添加500 mg/kg 的阿魏酸。

1.2.3 微生物計數取20 g 香腸， 加入到180 mL無菌生理鹽水中，在200 r/min 室溫下搖1 h。 混合液稀釋后于對應固體培養基進行均勻涂布。 乳酸菌用MRS 培養基，在37 ℃條件下培養72 h；葡萄球菌/微球菌用MSA 培養基，37 ℃培養48 h； 腸細菌用VRBGA 培養基，30 ℃培養48 h。 假單胞菌屬用假單胞菌屬選擇性培養基，25 ℃培養48 h。

1.2.4 樣品pH 值測定無菌條件下稱取樣品20 g于180 mL 滅菌生理鹽水中，在200 r/min 室溫下搖1 h，用pH 計進行上部清液pH 值測定。

1.2.5 水分含量測定準確稱取樣品2 g 于平板中，于105 ℃干燥箱中烘干至質量恒定，取出置于干燥皿中冷卻，計算出水分含量。

1.2.6 細菌DNA 組的提取無菌條件下取樣品20 g 于180 mL 滅菌生理鹽水， 使用物料拍打機拍打20 min， 取上清液5 mL 在4 ℃條件下2500 r/min離心5 min，去沉淀，取上清液于干凈離心管中4 ℃條件下10000 r/min 離心20 min，棄去上清液，用滅菌的移液槍將沉淀轉移至1.5 mL 離心管中，然后根據細菌DNA 提取試劑盒操作步驟提取總DNA，提取的DNA 中加入150 μLTE 緩沖液，于-20 ℃保存備用。

1.2.7 PCR-DGGE

1）PCR 對所分離菌的16S rDNA 的V6-V8 區段進行PCR 擴增， 選用引物對為： 上游引物：ChdcDG-F （5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGG GCGGGGGCACGGGGGCCTGGTCAAGGCTATGGTG TATGGTC -3′ ） 下 游 引 物：hdcDG -R （5′ -GGTTTCATCATTGCGTGTGCAAA-3′）[15]。

PCR 反應為25 μL 體系：1 μL 模板DNA，上游引 物 和 下 游 引 物 各1.5 μL，2 × Taq PCR Master Mix12 μL，ddH2O 9 μL。

擴 增 程 序：94 ℃預 變 性5 min，35個 循 環（94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；68 ℃，30 s）， 最終68 ℃延伸10 min。用1.5 g/dL 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物后，進行DGGE 分析。

2）變性梯度凝膠電泳（DGGE） 聚丙烯酰胺凝膠質量濃度為8 g/dL （丙烯酰胺∶甲叉雙丙烯酰胺37.5 g∶l g）。 變性梯度從35%～55%，制好膠后點樣，在0.5×TAE 緩沖液中， 先200 V 電壓預跑15 min，然后在80 V 恒壓下電泳14 h。 將DGGE 膠片在含0.5 μL/mL EB 的超純水中搖床染色20 min。再用超純水20 min 脫色3次后，用凝膠成像儀拍照。 在紫外燈照射下用滅菌的刀片切割所需的明亮條帶，放入無菌的1.5 mL 離心管中， 加入20 μL TE 溶液淹沒切割下的條帶，4 ℃冰箱過夜后， 再次進行PCR擴增 （上游引物為U968：5′-AACGCGAAGAACCT TAC-3′； 下游引物為L1401：5′-CGGTGTGTACAA GACCC-3′），反應體系同1.2.7.1，擴增程序：95 ℃預變性10 min，35個循環（95 ℃，30 s；56 ℃，30 s；72℃，30 s），最終72 ℃延伸10 min。 PCR 產物送去華大測序。 將測序結果與NCBI 數據庫中序列進行比對，對菌株進行鑒定，結果見表2。

1.2.8 HPLC 測定熏馬腸中組胺和游離組氨酸的含量

1） 組胺含量的測定 準確稱取組胺50 mg，用0.4 mol/L 的高氯酸溶液定容到50 mL 容量瓶中，稀釋至最終質量濃度為：10、50、100、150、200 μg/mL組胺標準液。 參考張雅晴[14]的方法來測定熏馬腸中的組胺。

2）游離組氨酸含量的測定[16]精密稱取組氨酸對照品20 mg，用0.1 mol/L 的鹽酸定容至10 mL 容量瓶中， 稀釋成一定質量分數的組氨酸標準溶液。取1 mL 的組氨酸標準液， 加入500 μL 0.1 moL/L異硫氰酸苯酯-乙腈溶液（移取異硫氰酸苯酯1.2 mL用乙腈容至100 mL 容量瓶中） 和500 μL 1 moL/L三乙胺-乙腈溶液（移取三乙胺13.5 mL 用乙腈定容至100 mL 容量瓶中），搖勻靜置1 h，加入2 mL 正乙烷萃取，吸取下層溶液過膜，上機分析。

取2 g 熏馬腸樣品加入，30 mL 的0.1 mol/L 的鹽酸，超聲提取（40 kHz）45 min，放冷離心，收集上清液待用。 取上述處理液1 mL，此后衍生處理方法同上。色譜柱為Agilent C18（4.6 mm×250 mm），流量1 mL/min，流動相A：醋酸鈉7.5 g，加超純水850 mL溶解，用乙酸調pH 6.5，加水至925 mL 加乙腈70 mL，搖勻。 流動相B：體積分數80%乙腈水。 用0.22 μm 濾膜過濾超聲30 min 后備用，紫外檢測波長為254 nm，進樣體積20 μL，柱溫31 ℃，梯度洗脫：0～18 min，A（100%～91%）；18.01～50 min，A（80%～67%）；50.01～60 min，A（0%）。

1.2.9 數據分析全部試驗數據采用Microsoft Excel 2010 統計，Origin 8.5 繪圖，SPSS 22 進行差異性分析。

2 結果與分析

2.1 理化指標的分析

2.1.1 水分質量分數由表1 可知，熏馬腸發酵過程中水分質量分數呈下降趨勢，在發酵成熟過程中由于較高的發酵溫度及較低的相對濕度使得水分質量分數下降顯著（P＜0.05），到發酵成熟結束時對照組樣品中水分質量分數為37.73%，相比發酵初期0 d（75.13%）下降了49.78%。 不同添加量的阿魏酸處理組與對照組相比水分質量分數變化的差異不顯著（P＞0.05），說明阿魏酸對熏馬腸的水分質量分數無影響。 這與楊蓉蓉等[17]在八角茴香提取物對風干鱸魚加工貯藏過程中水分質量分數的實驗結果較為相似。

2.1.2 pH 值由表1 可知，熏馬腸發酵過程中pH值呈先下降后上升的趨勢。 添加阿魏酸組熏馬腸中的pH 值要低于未添加阿魏酸組（P＞0.05），主要是由于阿魏酸本身的酸性，在熏馬腸的整個發酵成熟過程中pH 始終保持在酸性范圍（＜5.32）。 4 組熏馬腸在發酵初期（0～7 d），pH 值迅速下降，主要是由于加工過程中碳水化合物水解作用產生的乳酸、磷酸等其他有機酸的積累，酶促水解作用產生的游離氨基酸的累積[18]，使pH 值顯著下降（P＜0.05）。 發酵后期（14～28 d），pH 值開始回升，主要原因是在成熟過程中，微生物生長代謝產生大量的含氮化合物等堿性緩沖物質如組胺的積累，以及蛋白質代謝產物的釋放。 在發酵結束后， 各組樣品的pH 值都處于5.14～5.26 之間，這與Lu 等[19]在研究熏馬腸發酵過程中pH 值的實驗結果一致。 而pH 值為5 左右的酸性條件有利于維持發酵香腸貨架期的穩定性，各組終產品中的結果都符合香腸的這個要求。

2.2 微生物分布的分析

2.2.1 乳酸菌分析由表1 可知，隨著熏馬腸發酵過程的進行，各組乳酸菌數量均先上升后下降的趨勢。 添加阿魏酸后各組的乳酸菌數量與對照組相比較低（P＞0.05）。 4個不同處理組的樣品中乳酸菌數量（lg（CFU/g））在第7 天時達到最大值8.15～8.29，可能與發酵后期較高的pH 值有關。 發酵結束 （第28 天）時，對照組乳酸菌總數（lg（CFU/g））為7.61±0.03，添加阿魏酸500 mg/kg 組乳酸菌總數（lg（CFU/g））為7.43±0.04，相對于對照組降低了2.37%。 楊蓉蓉等[17]研究了0、50、100、150、200 mg/kg 的八角茴香提取物對風干鱸魚加工及貯藏過程中微生物的抑制效應，結果顯示，風干結束時，添加500 mg/kg 八角茴香提取物處理組樣品中乳酸菌總數相對于對照組降低了6.88%，相對于八角茴香提取物，阿魏酸對乳酸菌的抑菌作用要弱。 乳酸菌是熏馬腸中的優勢菌，主要是由于原料肉中乳酸菌數量較多以及它們在發酵過程中較快的繁殖速度。 發酵后期4 組樣品中乳酸菌數量（lg（CFU/g））在7.43～7.61 范圍之間。 與國際上建議的乳酸菌在食品中的數量（lg（CFU/g））范圍6～8 相符[20]，說明產品安全性較高。

2.2.2 微球菌/葡萄球菌分析4 組熏馬腸中微球菌/葡萄球菌數量與乳酸菌數量的變化趨勢一致（表1），都是先上升后下降。發酵28 d 時，各組樣品中的微球菌/葡萄球菌數量（lg（CFU/g））在6.34～6.93 之間，與一些學者報道的熏馬腸中微球菌數量相近[17]。使用阿魏酸能顯著抑制熏馬腸終產品中微球菌/葡萄球菌的生長（P＜0.05），發酵后期3 組添加阿魏酸組的熏馬腸中微球菌/葡萄球菌數量相對于空白對照組分別降低了3.17%、5.92%、8.51%。 呂珍等在阿魏酸對酒類酒球菌生長作用機理的研究中也發現：50 mg/L 阿魏酸能夠強烈抑制酒類酒球菌的生長，并且隨阿魏酸含量的增加抑制作用逐漸增強[21]。 何粉霞在阿魏酸和阿魏酸葡萄糖酯的生物活性研究中也發現阿魏酸對枯草桿菌、金黃色葡萄球菌和酵母菌均有一定的抑制效果[22]。

表1 阿魏酸對新疆熏馬腸成熟過程中微生物和理化指標的影響Table 1 Microbial counts （lg（CFU/g）） and physicochemical parameters during ripening of smoked horsemeat sausage after adding different concentrations of ferulic acid

2.2.3 腸細菌和假單胞菌屬分析由表1 可知，在發酵初期（0 d），腸細菌和假單胞菌屬的數量（lg（CFU/g））分別在3.20 和2.01 左右，與Lu 等[19]在熏馬腸中的研究結果相似。 在整個發酵過程中，各組腸細菌數量均呈下降的趨勢（P＜0.05）。 添加阿魏酸后Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組腸細菌數量顯著低于對照組中腸細菌數量（P＜0.05）。 成熟第28 天時， 添加阿魏酸300 mg/kg 和500 mg/kg 組熏馬腸樣品中均未檢測到腸細菌，另外在添加阿魏酸后，各組在發酵成熟期也都沒有檢測到假單胞菌屬。 Lu 等[19]在發酵劑和植物提取物對熏馬腸中生物胺的研究中指出，添加植物提取物后，在發酵后期均沒有檢測到腸細菌和假單胞菌屬。 說明阿魏酸和植物提取物對腸細菌和假單胞菌屬的生長都具有顯著的抑制效果（P＜0.05）。王永麗等[23]在辣素對培根風干成熟過程中微生物的抑制效應中發現， 添加500 mg/kg 姜辣素處理組的腸細菌數量相對于空白對照組降低了19.44%，這說明阿魏酸對腸細菌的抑菌作用比姜辣素強。 腸細菌和假單胞菌屬是一類在發酵香腸中不受歡迎的菌種，很可能導致致病性危害以及對發酵香腸的感官品質造成影響，尤其是一些大腸桿菌可以產生大量組胺。 實驗結果表明，阿魏酸能有效地抑制腸細菌和假單胞菌屬的生長，從而抑制組胺在熏馬腸發酵成熟過程中的積累。

2.3 DGGE 的分析

如圖1 DGGE 電泳圖所示，熏馬腸發酵過程中主要的產組胺微生物是Lactobacillus sakei，Enterobacter cloacae和Bacillus cereus（見 表2）。Maria Diaz 等[15]在使用PCR-DGGE 方法鑒定奶酪中產組胺菌的研究中得到Lactobacillus sakei是奶酪中的產組胺菌。Enterobacter cloacae和Bacillus cereus在很多文獻里也曾被報道是潛在的產組胺微生物[24-25]。 發酵前期，添加阿魏酸組與未添加阿魏酸組中存在的產組胺微生物相似。 在熏馬腸成熟的第7 天時， 添加阿魏酸500 mg/kg 組熏馬腸樣品中沒有檢測到這些產組胺微生物，成熟第28 天時，添加阿魏酸300 mg/kg 和500 mg/kg 組熏馬腸樣品中均未檢測到這些產組胺微生物，這與微生物的統計結果基本一致。 說明阿魏酸對這些產組胺微生物有很好的抑制作用。

圖1 阿魏酸對新疆熏馬腸成熟過程中產組胺菌的PCRDGGE 圖譜Fig. 1 DGGE fingerprinting of PCR products of Xinjiang smoked horsemeat sausage during ripening by addition of ferulic acid at different concentrations

2.4 熏馬腸中的游離組氨酸和組胺的分析

表2 熏馬腸成熟過程中產組胺菌PCR-DGGE 圖譜上條帶序列分析Table 2 DNA sequencing results of histamine-producing bacterias found in smoked horsemeat sausage samples based on the cut bands from the DGGE gels

2.4.1 游離組氨酸阿魏酸對熏馬腸發酵過程中的游離組氨酸影響情況如圖2 所示。 隨著發酵過程的進行，各組游離組氨酸均呈上升趨勢，Zhang 等[26]在鯉魚香腸的發酵成熟過程中也發現游離組氨酸的這種變化趨勢。 添加阿魏酸Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組游離組氨酸與未加阿魏酸組中的組氨酸質量分數沒有明顯差異（P＞0.05），說明阿魏酸對熏馬腸發酵過程中游離組氨酸的釋放不起作用。發酵成熟期（28 d），各組熏馬腸中的游離組氨酸質量分數為1.89 mg/kg 左右，與Domínguez 等[27]在干腌小馬駒香腸中的研究結果相似。 熏馬腸發酵過程中組氨酸量的變化是一個動態過程：一方面，蛋白酶不斷水解蛋白質生成組氨酸，組氨酸量增加；另一方面，微生物生長消耗部分組氨酸產生組胺。 但是本實驗中組胺的生成與游離組氨酸的減少之間不成正比關系，這與Nie 等[28]在鯉魚香腸中的研究結果相似。

圖2 阿魏酸對新疆熏馬腸成熟過程中游離組氨酸的影響Fig. 2 Changes of free histidine contents in Xinjiang smoked horsemeat sausage during ripening affected by addition of ferulic acid at different concentrations

2.4.2 組胺由圖3可知，熏馬腸發酵過程組胺質量分數呈先上升后下降的趨勢，Lu 等[19]在熏馬腸中也發現組胺質量分數的這種變化趨勢。 發酵初期（0 d） 時，4 組熏馬腸中的組胺質量分數都很少，說明選擇的原料肉安全性很高。 在發酵第7 天時，對照組的組胺質量分數達到111.12 mg/kg， 超出了Nout 等[29]指出香腸制品中組胺的允許水平100 mg/kg。 在發酵后期（第28 天），300 mg/kg 添加量時組胺質量分數為30.71 mg/kg，相對于對照組降低了43.26%，為組胺質量分數最低的一組。 李彬彬等[14]也在熏馬腸中添加250 mg/kg 的大蒜精油，發現在發酵后期， 組胺量較空白對照組降低了66.64%，張惠超等[30]在熏馬腸中接種生物胺氧化酶菌作為發酵劑，發現生物胺氧化酶菌具有較好的氧化組胺能力，其中以腐生葡萄球菌最為顯著，與對照組相比降低了49.28%。雖然阿魏酸對組胺量的減少低于大蒜精油和生物胺氧化酶，但是阿魏酸作為天然植物提取物，對癌癥、糖尿病、心血管和神經性疾病等都具有廣泛的治療作用，在發酵香腸中具有很好的應用前景。 100 mg/kg 阿魏酸降低組胺質量分數的作用均不如300 mg/kg 與500 mg/kg 明顯，300 mg/kg 與500 mg/kg 的組間差異不顯著（P＞0.05）。所以質量分數為300 mg/kg 的添加量更適合應用于熏馬腸的生產。 4 組熏馬腸終產品中組胺質量分數都遠遠低于FDA 限量標準，大量研究也曾得到組胺質量分數在其他類發酵香腸中較低，但是熏馬腸中的組胺仍是大家值得關注的問題，因為腐胺和尸胺在一定條件下能夠增強組胺的毒性[31]。 添加阿魏酸后，熏馬腸中產組胺微生物的生長受到抑制（圖1），所以組胺量明顯降低（P＜0.05）。

圖3 阿魏酸對新疆熏馬腸成熟過程中組胺的影響Fig. 3 Changes of histamine contents in Xinjiang smoked horsemeat sausage during ripening affected by addition of ferulic acid at different concentrations

3 結 語

阿魏酸對熏馬腸發酵過程中的水分含量、pH值以及游離組氨酸的變化無顯著差異（P＞0.05）。 阿魏酸能顯著（P＜0.05）抑制腸細菌、微球菌/葡萄球菌以及假單胞菌屬的生長繁殖，對乳酸菌的抑制作用不顯著（P＞0.05）。 通過PCR-DGGE 分析得到，阿魏酸能夠很好地抑制產組胺微生物（Lactobacillus sakei，Enterobacter cloacae 和Bacillus cereus） 的生長，對控制組胺在熏馬腸中的含量起到非常顯著的作用。 300 mg/kg 的阿魏酸處理組對于組胺抑制效果最好， 為30.71 mg/kg， 相對于對照組降低了43.26%，500 mg/kg次之。 所以300 mg/kg 的添加量適合應用于熏馬腸的生產。