pH 值對(duì)芽孢皮層裂解酶活性及結(jié)構(gòu)的影響

郭洪偉， 馬慧嬌， 郭家俊， 曾朝瑋， 章 中

（寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川750021）

芽孢是細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)體在缺乏營(yíng)養(yǎng)的條件下形成的休眠態(tài)，對(duì)輻照、超高壓、熱、超聲波、微波、化學(xué)物質(zhì)等各類(lèi)殺菌處理有極端抗性[1-2]，是導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)的根本原因。 芽孢萌發(fā)后失去其極端抗性，有許多因素能誘導(dǎo)芽孢的萌發(fā)，如營(yíng)養(yǎng)素、超高壓、陽(yáng)離子表面活性劑、機(jī)械擦傷、外源DPA（2，6-吡啶二羧酸）、外源裂解酶等[3]。 芽孢中最常見(jiàn)的皮層裂解酶是CwlJ 和SleB， 這2 種酶位于芽孢內(nèi)膜和外膜上，它們對(duì)芽孢的萌發(fā)具有專一性。 芽孢被激活后，這2 種酶將芽孢皮層水解然后導(dǎo)致芽孢核心的完全水化。無(wú)論是CwlJ 或SleB 都可使皮層降解，缺乏這2 種酶其皮層便無(wú)法降解和無(wú)法完成萌發(fā)。Brown W C[4]等報(bào)道pH＜7 的N-乙酰胞壁酸會(huì)抑制芽孢孢子的萌發(fā)，該抑制劑還抑制了2 種萌發(fā)相關(guān)酶的活性。Blocher J C[5]等報(bào)道在pH 值為6.5 時(shí)，添加山梨酸完全抑制了肉毒梭菌孢子的萌發(fā)， 在pH值為5.5 時(shí)， 未添加山梨酸的菌株孢子的萌發(fā)并沒(méi)有受到抑制作用。 Sheng S 等[6]報(bào)道枯草芽孢桿菌孢子CotA 的最大活性保持在pH 值為4～5 之間，可以用于固定孢子的惰性基質(zhì)中， 在制備生物催化劑中，產(chǎn)率可以大大提高。 Porebska I 等[7]報(bào)道芽孢桿菌孢子在酸性果汁中的萌發(fā)受到了抑制。 但是萌發(fā)程度取決于菌種和時(shí)間、 孵化和使用的營(yíng)養(yǎng)化合物，并不全取決于pH。 由此可知，酸性條件會(huì)對(duì)菌體的生長(zhǎng)和活性有影響，對(duì)細(xì)菌芽孢的萌發(fā)有一定的抑制作用，但其抑制機(jī)理是什么，是不是因?yàn)樗嵋种屏搜挎咂恿呀饷傅幕钚裕@尚不清楚，有待于深入研究。 目前國(guó)內(nèi)外研究芽孢皮層裂解酶的相關(guān)報(bào)道極少， 且未見(jiàn)關(guān)于pH 處理對(duì)芽孢皮層裂解酶活性和結(jié)構(gòu)影響的相關(guān)報(bào)道，故推斷存在2 種可能性：其一是酸性pH 值對(duì)皮層裂解酶有抑制作用，這種抑制作用導(dǎo)致細(xì)菌芽孢不萌發(fā)； 其二是酸性pH 值對(duì)皮層裂解酶無(wú)抑制作用，酸抑制芽孢的萌發(fā)另有原因。

目前，傅立葉變換紅外吸收光譜儀（FT-IR）有高靈敏度、高分辨率、高效掃描及高度計(jì)算機(jī)化等長(zhǎng)處， 是研究蛋白質(zhì)分子內(nèi)氫鍵的一種有效方法，常用來(lái)估測(cè)多肽和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)[8-10]。熒光分光光度計(jì)能夠掃描液相熒光標(biāo)記物發(fā)射出的熒光光譜，近年來(lái)經(jīng)常被用來(lái)分析蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。 酶有最適的pH 值范圍，并且對(duì)酸堿度的調(diào)節(jié)極其敏感，pH值能導(dǎo)致鹽橋的變化，并加強(qiáng)其三級(jí)結(jié)構(gòu)，故利用這些儀器研究不同pH 處理后皮層裂解酶（CwlJ）的結(jié)構(gòu)變化非常有必要。

為研究酸性pH 值對(duì)芽孢萌發(fā)的抑制機(jī)理，本文作者從研究pH 處理對(duì)皮層裂解酶（CwlJ）的活性的影響規(guī)律著手，結(jié)合酶結(jié)構(gòu)變化的研究，分析皮層裂解酶 （CwlJ） 的活性和結(jié)構(gòu)是否受pH 值的影響，進(jìn)而揭示酸性pH 值對(duì)芽孢萌發(fā)的抑制機(jī)理，這對(duì)研究芽孢的萌發(fā)有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

皮層裂解酶CwlJ（純度＞90%）：南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；脫芽孢衣溶液，作者所在實(shí)驗(yàn)室制備；Tris-HCl 緩沖液： 北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；溴化鉀（色譜純）：美國(guó)Sigma-Aldrich 公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

Spectrum Two 型紅外光譜儀：美國(guó)PerkinElmer公司產(chǎn)品；Scientz-1LS 真空冷凍干燥離心濃縮儀：寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；DHG-9245A電熱鼓風(fēng)干燥箱： 上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；XMTD-6000 型電子恒溫不銹鋼水浴鍋：上海宜昌儀器紗篩廠制造；UV-2450 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)： 日本島津公司產(chǎn)品；970CRT 熒光分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 CwlJ 凍干粉的前處理將CwlJ 凍干粉混入摩爾濃度為0.02 mol/L 的Tris-HCl 緩沖液中， 配成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 的酶溶液，為pH 的處理，測(cè)酶活和酶的二三級(jí)結(jié)構(gòu)提供原材料。

1.3.2 pH 處理CwlJ 酶溶液用稀HCl 和稀H2SO4調(diào)節(jié)其溶液體系的pH 值，將CwlJ 溶液分別處理成pH 3、5、7、9、11 的酶溶液體系。

1.3.3 酶活性的測(cè)定CwlJ 的酶活計(jì)算方法可用Makino[11]的方法。在32 ℃下，通過(guò)測(cè)出1 cm 光路內(nèi)脫芽孢衣的芽孢懸浮液的OD600值的減少量來(lái)分析酶活。 反應(yīng)終產(chǎn)物體積為5 mL，包含1 mL 脫芽孢衣芽孢混合液和4 mL 酶液， 酶液包含Tris-HCl 緩沖液和皮層裂解酶CwlJ，酶活性單位（U/L）定義為：每分鐘OD600值降低0.001 所需的酶量。 每10 min測(cè)一次OD600值， 根據(jù)80 min 內(nèi)OD600值變化量計(jì)算酶活。

計(jì)算公式為：

式中：X 為酶活（U/L）；t 為反應(yīng)時(shí)間（min）；V 為參與反應(yīng)的酶量（mL）。

1.3.4 傅立葉紅外光譜分析采用KBr 壓片法制樣[12]：溴化鉀達(dá)到色譜純純度，溴化鉀取200 mg，樣品取2 mg，在瑪瑙研缽中研磨，在170 ℃烘箱中烘24 h 以上，干燥密封保存。 用無(wú)水乙醇酒精棉球?qū)Ω盗⑷~紅外變換光譜儀以及研缽等器皿進(jìn)行消毒。使用波長(zhǎng)為400～4000 nm 的傅立葉紅外變換光譜儀對(duì)CwlJ 進(jìn)行全波段掃描，掃描次數(shù)為32次，分辨率為4 cm-1，每個(gè)樣品測(cè)量重復(fù)3次，取平均值。

1.3.5 FT-IR 譜圖處理選用Omnic 8.0 軟件處理， 采集酰胺I 帶的波段， 進(jìn)行FT-IR 去卷積，標(biāo)峰，做基礎(chǔ)紅外光譜圖分析。 利用Peakfit 4.12 軟件對(duì)譜峰進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，平滑，去基線，求二階導(dǎo)數(shù)，尋找峰， 在二階導(dǎo)數(shù)原譜和酰胺I 帶紅外原譜的基礎(chǔ)上進(jìn)行Gauss Amp 連續(xù)擬合，進(jìn)行多次擬合使殘差值最小化（R2≥0.999），直至R2值不變?yōu)橹筟13]。 得到子峰數(shù)目為9～13 之間， 確定各個(gè)子峰的峰面積與CwlJ 的二級(jí)結(jié)構(gòu)之間的比例關(guān)系，根據(jù)峰面積計(jì)算各種條件下峰的二級(jí)結(jié)構(gòu)歸屬[14]。

1.3.6 熒光光譜分析配制質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的CwlJ 溶液，掃描其熒光值。 設(shè)定熒光分光光度計(jì)條件： 掃描范圍為200～500 nm， 掃描速度為200 nm/min，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫寬均為10 nm，響應(yīng)時(shí)間為0.1 s，記錄數(shù)據(jù)波長(zhǎng)間隔為1 nm。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析所有實(shí)驗(yàn)最少重復(fù)3次，再用統(tǒng)計(jì)軟件Origin 9.0 作圖和分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH 處理對(duì)CwlJ 的活性的影響

在最適反應(yīng)溫度32 ℃的條件下， 分別測(cè)定不同pH 值（3、5、7、9、11）的體系中CwlJ 的活力，確定最適反應(yīng)pH 值[15]。 CwlJ 會(huì)造成脫芽孢衣芽孢的萌發(fā)，芽孢萌發(fā)時(shí)，其核心水化，造成折光性發(fā)生變化，表現(xiàn)為脫芽孢衣溶液的OD600值明顯下降，下降水平越大，芽孢的萌發(fā)率就越高，皮層裂解酶活性也就越高[16-17]。

CwlJ 對(duì)pH 值的變化極其敏感見(jiàn)圖1。 當(dāng)對(duì)照是無(wú)菌水和脫芽孢衣溶液的混合液時(shí)，隨著時(shí)間的變化，對(duì)照組的OD600值基本不變；pH 值為3 和pH值為5 的OD600值下降最明顯，說(shuō)明CwlJ 的活性保持較好，pH 值為5 是活性最高點(diǎn)；pH 值為7，pH 值為9 和pH 值為11 的OD600值的變化基本相同，都有顯著下降，但下降幅度較低，說(shuō)明當(dāng)溶液中酸堿度開(kāi)始趨近于中性和堿性時(shí)，酶活已經(jīng)開(kāi)始受到一定的抑制作用，隨著處理時(shí)間的增長(zhǎng)，酶活的降低更顯著。 Miyata 等[18]研究發(fā)現(xiàn)：當(dāng)pH 值在7.2～8.4時(shí)，皮層裂解酶活力最佳，當(dāng)pH 值為4.2 時(shí)，皮層裂解酶基本失活，這一研究報(bào)道也是關(guān)于皮層裂解酶的，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果與本文有一定差異，可能因?yàn)榫N不同，本實(shí)驗(yàn)是從枯草芽孢桿菌中分離純化得出的皮層裂解酶，而皮層裂解酶中有CwlJ 和SleB，皮層裂解酶的相對(duì)分子質(zhì)量，分子結(jié)構(gòu)均不同，對(duì)pH變化的耐受程度也不同， 而本實(shí)驗(yàn)研究的是CwlJ，所以推測(cè)皮層裂解酶中的SleB 可能會(huì)在酸性條件下失活，而CwlJ 的活性在pH 值為3～5 左右最高，非常適宜在弱酸性條件下水解芽孢皮層而導(dǎo)致芽孢萌發(fā)。 可以推測(cè)，在酸性pH 條件下芽孢不萌發(fā)的原因不全是因?yàn)槠恿呀饷富钍艿接绊慬19]，有可能和營(yíng)養(yǎng)素受體、DPA 釋放等原因有關(guān)， 原因有待進(jìn)一步研究。

圖1 不同pH 處理?xiàng)l件下皮層裂解酶CwlJ 活力的變化趨勢(shì)Fig. 1 Change trend of CwlJ activity of skin lyase under different pH treatment conditions

2.2 不同pH 處理下CwlJ 的FT-IR 譜圖的變化

利用傅立葉紅外光譜儀對(duì)不同pH 處理下的CwlJ 進(jìn)行全波段掃描，得到如圖2 的FT-IR 譜圖以及各譜帶特性（表1），從圖2 中能夠看到全波段的FT-IR 譜圖的結(jié)構(gòu)變化。 如圖3 可看到不同pH 處理?xiàng)l件下的CwlJ 的譜型基本相同， 但在3600～3300 cm－1的寬吸收峰強(qiáng)度不斷加強(qiáng)，表明不同pH處理能引起CwlJ 的分子內(nèi)和分子間的氫鍵增強(qiáng)。最常用的分析蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)即是在1700～1600 cm-1， 酰胺I 帶的震動(dòng)頻率主要取決于C＝O之間氫鍵的性質(zhì)，隨著pH 的增大，羰基（C＝O）的伸縮震動(dòng)越來(lái)越微弱， 故可觀察1700～1600 cm-1的波長(zhǎng)范圍的變化來(lái)研究CwlJ 的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

圖2 不同pH 處理?xiàng)l件下皮層裂解酶CwlJ 的FT-IR 譜圖Fig. 2 FT -IR spectra of cortical lyase CwlJ under different pH treatment conditions

表1 FT-IR 譜圖的各譜帶特性[20-21]Table 1 Characteristics of FT-IR spectra

隨著pH 的增大，從峰形變化分析，峰形由大的波動(dòng)逐漸變?yōu)樾〉牟▌?dòng)， 見(jiàn)圖3。 從峰位變化分析，pH 值為3 的CwlJ 的酰胺I 帶為1629.5 cm-1， 隨著pH 值的逐漸增大， 在對(duì)其進(jìn)行酸堿度的調(diào)節(jié)過(guò)程中，酸堿度由pH 值為3 到pH 值為5 時(shí)，CwlJ 的酰胺I 帶向低波數(shù)方向進(jìn)行不斷的平移， 紅移約0.5 cm-1，即由1629.5 cm-1移至1629.0 cm-1；當(dāng)pH 值為7 時(shí)，酰胺I 帶的波數(shù)保持不變趨于穩(wěn)定狀態(tài)。隨著pH 調(diào)節(jié)為堿性狀態(tài)的過(guò)程中，從pH 值為7 調(diào)節(jié)到pH 值為9 時(shí)，CwlJ 的酰胺I 帶向高波數(shù)方向不斷的平移， 紅移約35 cm-1， 即由1629.0 cm-1移至1664.0 cm-1，紅移波數(shù)值比較大；當(dāng)pH 值為9 調(diào)節(jié)到pH 值為11 時(shí)， 酰胺I 帶向高波數(shù)不斷的平移， 紅移約0.5 cm-1。 這表明CwlJ 的結(jié)構(gòu)會(huì)隨著pH 的改變而改變，具有酸堿不穩(wěn)定性，這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)中氨基酸肽鏈與外圍介質(zhì)構(gòu)成氫鍵，當(dāng)氫鍵作用較強(qiáng)時(shí)，C＝O 的電子云密度下降， 吸收帶向低波數(shù)紅移； 當(dāng)氫鍵作用較弱時(shí)，C＝O 的電子云密度加強(qiáng)，吸收帶向高波數(shù)紅移[22-23]。 說(shuō)明pH 處理會(huì)直接影響CwlJ 的原空間結(jié)構(gòu)， 在調(diào)節(jié)酸堿度的過(guò)程中CwlJ 的分子內(nèi)氫鍵會(huì)受到影響， 對(duì)CwlJ 的活性也會(huì)產(chǎn)生抑制作用。

2.3 不同pH 處理下CwlJ 酰胺I 帶的擬合

酰胺I 帶是評(píng)價(jià)與分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的重要分析手段。研究表明[24]，F(xiàn)T-IR 中酰胺Ⅰ帶的峰形受蛋白質(zhì)主鏈結(jié)構(gòu)即二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，酰胺Ⅱ帶和酰胺Ⅲ帶與二級(jí)結(jié)構(gòu)只存在間接的影響。 在蛋白質(zhì)的FT-IR 圖譜中， 蛋白質(zhì)的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲等二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)的振動(dòng)吸收峰互相折疊形成一寬峰，即酰胺Ⅰ帶[25]。在對(duì)酶進(jìn)行傅立葉紅外光譜分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)全部表現(xiàn)在酰胺I 帶圖譜中， 酰胺I 帶的二階導(dǎo)數(shù)表明其各個(gè)波數(shù)所對(duì)應(yīng)的不同的積分面積[26]，在蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析中， 一般采用曲線擬合的方法，對(duì)CwlJ 酰胺I 帶進(jìn)行基線修正，高斯去卷積，求二階導(dǎo)數(shù)，曲線擬合，求出峰面積，確定分峰數(shù)量是否正確，依據(jù)峰面積估算各二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量[27]。其中酰胺Ⅰ帶各峰位為：1615～1637 cm－1和1682～1700 cm－1為β-折疊特征峰；1646～1664 cm－1為α-螺旋特征峰；1637～1645 cm－1為無(wú)規(guī)卷曲特征峰；1664～1681 cm－1為β-轉(zhuǎn)角特征峰[28]。

圖3 不同pH 處理?xiàng)l件下皮層裂解酶CwlJ 的酰胺I 帶紅外原譜Fig. 3 IR spectra of the amide I band of CwlJ in the skin under different treatment conditions

圖4 為pH 值為3、5、7、9、11 的CwlJ 的酰胺I帶經(jīng)去卷積和二階導(dǎo)數(shù)處理后獲得的疊加峰分解為各個(gè)子峰的高斯曲線擬合峰圖。 由表2 和表3 的峰面積比例求出其結(jié)構(gòu)歸屬。CwlJ 的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要組成為α-螺旋，其次是β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲； 大小為α-螺旋＞β-折疊＞β-轉(zhuǎn)角＞無(wú)規(guī)則卷曲。經(jīng)過(guò)pH 處理后的CwlJ 的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生如下變化：1） 隨著pH 的增大，α-螺旋先增大后減小，pH 值從3 到9，α-螺旋逐漸增大；pH 值從9 到11，α-螺旋不斷的減小。α-螺旋是蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中最穩(wěn)定的，隨著pH 的增大，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生重新排列[29]，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性下降，直接導(dǎo)致CwlJ 的α-螺旋中的C＝O 雙鍵電子云密度不穩(wěn)定， 氫鍵直接斷裂并與其他極性基團(tuán)發(fā)生氫鍵鍵合，發(fā)生解螺旋，影響皮層裂解酶CwlJ 活性中心的構(gòu)象，活性變低；2）隨著pH 的增大，無(wú)規(guī)則卷曲狀態(tài)先增大后減小，pH 值從3 到7，無(wú)規(guī)則卷曲狀態(tài)由15.13%增加到17.18%，pH 值從7 到9， 無(wú)規(guī)則卷曲狀態(tài)由17.18%降低到15.46%， 表明隨著pH 的增加，CwlJ的二級(jí)結(jié)構(gòu)先從有序狀態(tài)逐漸向無(wú)規(guī)則狀態(tài)轉(zhuǎn)化，當(dāng)pH 值達(dá)到7 以上時(shí)，CwlJ 的二級(jí)結(jié)構(gòu)即從無(wú)規(guī)則狀態(tài)逐漸向有序狀態(tài)轉(zhuǎn)化[30]。 由此可證明pH 處理可能會(huì)導(dǎo)致CwlJ 發(fā)生水解， 空間結(jié)構(gòu)呈無(wú)序狀態(tài)，造成酶活降低；3）隨著pH 的增大，β-轉(zhuǎn)角先減小后增大，pH 值從3 到5，β-轉(zhuǎn)角由22.43%降低到19.37%，當(dāng)pH 值從5 到11，β-轉(zhuǎn)角由19.37%增加到21.38%，β-轉(zhuǎn)角本身屬于無(wú)序結(jié)構(gòu)， 經(jīng)處理后，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)很有可能會(huì)向無(wú)規(guī)則卷曲狀態(tài)轉(zhuǎn)化[31-32]。 這種轉(zhuǎn)化趨勢(shì)與高pH 處理下CwlJ 的變性和逐漸形成分散體的形態(tài)有關(guān)，外界對(duì)芽孢的一些處理?xiàng)l件下，芽孢的不萌發(fā)和保持休眠態(tài)的特性可能也與CwlJ 的變性以及CwlJ 的內(nèi)部結(jié)構(gòu)分散有緊密的聯(lián)系；4）隨著pH 的增大，β-折疊先增大后減小，pH值從3 到7，β-折疊相對(duì)含量不斷增加，β-折疊由26.29%增加到26.31%，pH 值從7 到11，β-折疊由26.31%增加到26.76%， 由于β-折疊比較常見(jiàn)于蛋白質(zhì)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)區(qū)域，pH 增加使得蛋白質(zhì)發(fā)生解聚現(xiàn)象是β-折疊先增加的原因， 隨著體系完全成為堿性時(shí)，蛋白質(zhì)大分子因?yàn)閴A性而聚集的現(xiàn)象導(dǎo)致β-折疊結(jié)構(gòu)減少， 由此可推斷β-折疊結(jié)構(gòu)在堿性聚集體形成的過(guò)程中起到重要作用，堿性聚集體的形成使CwlJ 的活性中心被包埋，進(jìn)而導(dǎo)致活性降低。

圖4 不同pH 處理?xiàng)l件下皮層裂解酶CwlJ 酰胺I 帶高斯曲線擬合圖Fig. 4 Gauss curve fitting of I band of CwlJ cleavage enzyme under different pH treatment conditions

表2 不同pH 處理?xiàng)l件下皮層裂解酶CwlJ 酰胺I 帶的不同波數(shù)的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量Table 2 Two level structure of different bands of CwlJ amide I band of the skin lyase under different pH treatment conditions

表3 不同pH 處理?xiàng)l件下皮層裂解酶CwlJ 酰胺I 帶二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量Table 3 Secondary structure of I band of CwlJ amide I under different treatment conditions

2.4 pH 處理對(duì)CwlJ 的熒光光譜分析

由圖5 可知，樣品在波長(zhǎng)300～400 nm 范圍內(nèi)，各個(gè)樣品的峰位，峰形都基本沒(méi)有發(fā)生變化，λmax沒(méi)有發(fā)生紅移，說(shuō)明pH 處理會(huì)導(dǎo)致CwlJ 的Trp 殘基暴露于親水環(huán)境中， 所以推測(cè)酶并沒(méi)有發(fā)生變性，相對(duì)來(lái)講，λmax也沒(méi)有發(fā)生藍(lán)移，說(shuō)明Trp 殘基自身的微環(huán)境并沒(méi)有發(fā)生改變，熒光基團(tuán)在親水環(huán)境中以相對(duì)穩(wěn)態(tài)的形式存在。 有出現(xiàn)特征峰，所有出現(xiàn)特征峰的最大激發(fā)波長(zhǎng)均為348 nm，但是出現(xiàn)最大激發(fā)波長(zhǎng)的峰強(qiáng)度顯著不同。

圖5 不同pH 處理?xiàng)l件下皮層裂解酶CwlJ 的熒光光譜Fig. 5 Fluorescence spectra of cortical lyase CwlJ under different pH treatment conditions

結(jié)合CwlJ 的活性實(shí)驗(yàn)得出，pH 值為5 的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，則說(shuō)明在pH 5 的條件下，CwlJ 的內(nèi)部蛋白質(zhì)完全展開(kāi)，空間結(jié)構(gòu)更加松散擴(kuò)張，環(huán)境相對(duì)處于穩(wěn)定狀態(tài)，CwlJ 的活性較高， 其活性在這個(gè)處理?xiàng)l件下被完全激活， 活性中心完全暴露， 引起CwlJ 的激活效應(yīng)；pH 值為11 的條件下，CwlJ 的熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，內(nèi)部結(jié)構(gòu)基本完全展開(kāi)，空間結(jié)構(gòu)比較疏松， 其活性減少；pH 值為7 的條件下，CwlJ 熒光強(qiáng)度不高，蛋白質(zhì)展開(kāi)了一部分，空間結(jié)構(gòu)比較緊密，活性減少的較強(qiáng)；在pH 值為3 和pH 值為9的條件下，CwlJ 的熒光強(qiáng)度非常低， 有可能是熒光基團(tuán)發(fā)生過(guò)度的暴露，引起熒光猝滅，導(dǎo)致空間結(jié)構(gòu)極其密集[33]，在pH 值為9 的條件下活性最低，但是在pH 值為3 的條件下CwlJ 的活性比較高，推測(cè)這有可能與Trp 殘基暴露于親水環(huán)境中， 肽鏈過(guò)度伸展有關(guān)。

3 結(jié) 語(yǔ)

實(shí)驗(yàn)表明不同pH 處理會(huì)改變芽孢皮層裂解酶（CwlJ）的活性、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，CwlJ 的活性與結(jié)構(gòu)呈正相關(guān)關(guān)系，結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，活性越強(qiáng)。 當(dāng)pH 值為3 和pH 值為5 時(shí)，CwlJ 的活性高， 當(dāng)pH值為9 時(shí)，CwlJ 活性最低， 由此可推測(cè)酸對(duì)芽孢萌發(fā)的抑制作用并不是因?yàn)槠湟种屏薈wlJ 的活性，這證明酸性pH 值抑制芽孢萌發(fā)的原因與其對(duì)皮層裂解酶（CwlJ）活性的作用無(wú)關(guān)。 本實(shí)驗(yàn)推進(jìn)了對(duì)細(xì)菌芽孢萌發(fā)機(jī)理的研究， 為芽孢深層機(jī)理的進(jìn)一步的探究夯實(shí)了基礎(chǔ)。