耐鹽性谷氨酰胺酶在Bacillus subtilis 168 中的整合表達

徐朝陽, 張 顯, 徐美娟, 楊套偉, 饒志明*

（1. 江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122；2. 江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室, 江蘇 無錫214122）

谷氨酰胺酶（EC 3.5.1.2）能將谷氨酰胺分解為谷氨酸和游離的氨氣。 人體內的谷氨酰胺酶主要分為腎型谷氨酰胺酶和肝型谷氨酰胺酶[1]，與細胞生長、代謝有關，可維持人體的酸堿平衡和內環境穩定。 谷氨酰胺酶還廣泛存在于曲霉、酵母、細菌等微生物中。 其中， 在微生物中， 研究較多的有Micrococcus luteusK-3[2-3]，Aspergillus oryzaeRIB40[4-5]，Bacillussp LKG-01[6]，Lactobacillus reuteriKCTC 3594[7]和Cryptococcus nodaensis[8]。 谷氨酰胺酶在日本醬油發酵過程中起著至關重要的作用，不僅可以增加醬油的風味，還可以增加醬油的營養成分。 但是，醬油釀造過程中的18%左右的高鹽環境限制了谷氨酰胺酶的應用。 MaMoru wakayama 等人[2]研究表明，來源于Micrococcus luteusK-3 在8%～16%的鹽濃度下可以穩定表達， 并且相對于無鹽條件下，酶活提高了1.3 倍。所以，我們合成編碼該谷氨酰胺酶的基因，將其在B. subtilis168 中表達。

枯草芽孢桿菌是一類非致病性細菌，被美國食品和藥物管理局評定為安全菌株（GRAS）[9]。 食品工業在全球商業應用中，枯草芽孢桿菌被人類和動物當作益生菌使用[10]，同時，它還能治療胃腸道疾病[11]。 枯草芽孢桿菌是一個食品級表達宿主[12]，可用于異源表達蛋白質和維生素[13]。

在微生物中，用質粒過表達外源基因時，在復制的過程中常出現不穩定的狀態（ssDNA）[14]，而導致質粒的丟失。 不添加抗生素條件下，會使這種現象很突出，從而限制了其在食品工業中的應用。 在之前的一項研究中，單拷貝β 半乳糖苷酶基因被整合到枯草芽孢桿菌的基因組DNA 中[15-16]，重組菌株的酶活很低，我們可以通過提高外源基因的拷貝數來提高其表達量。 堿性蛋白酶E（aprE）和中性蛋白酶E（nprE）被認為是主要的蛋白酶，因為它們的活性在枯草芽孢桿菌分泌總蛋白酶活性的20%和70%[17-19]。 選用蛋白酶作為整合表達位點，既可以增加外源基因的拷貝數，又可以降低蛋白酶對外源蛋白的降解。 本研究將來源于Micrococcus luteusK-3的谷氨酰胺酶基因（Mglu）[2]以lox序列重組的方式定點整合入B. subtilis168 中的nprE 和aprE 基因位點，進而得到食品級表達谷氨酰胺酶的重組菌株。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒和引物

菌株、質粒、引物如表1 所示。

表1 菌株、質粒、引物一覽表Table 1 Strains，plasmids and primers

續表1

1.2 培養基和試劑

LB 培 養 基（g/dL）：蛋 白 胨1，酵 母 膏 0.5，NaCl 1。

發酵培養基（g/dL）：葡萄糖2.5，安琪酵母4，NH4Cl 0.4，KH2PO40.1125，K2HPO4·3H2O 0.1875，CaCl20.2，L-谷氨酸鈉0.2；pH 7.0。

SPI 培養基（g/dL）：KH2PO40.6，K2HPO4·3H2O 1.83， （NH4）2SO40.2，Na3C6H5O7·2H2O 0.1，MgSO4·7H2O 0.02，葡萄糖0.5，酪蛋白水解物0.02，酵母提取物0.1，色氨酸0.005；115 ℃，滅菌25 min。

SPII 培養基：SPI 培養基體積分數98%，CaCl22.7 mg/L，MgCl20.48 mg/L；115 ℃，滅菌25 min。

100×EGTA：10 mmol/L EGTA 溶 液，NaOH 調pH 值至8.0。

質粒提取試劑盒、蛋白純化試劑盒、基因組提取試劑盒、PCR 試劑：購于中國大連市TaKaRa 公司。

1.3 重組B. subtilis 168 的構建

1.3.1 B. subtilis 168 基因組的提取B. subtilis 168 基因組的提取按照基因組提取試劑盒操作手冊進行。

1.3.2 整合片段同源臂的擴增通過NCBI 查詢可得到B. subtilis 168 aprE、nprE 基因的序列，選擇兩側大約600～700 bp 的片段作為同源臂，設計引物擴增同源臂。 同源臂PCR（聚合酶鏈式反應）體系中，模板為B. subtilis 168 基因組，aprE 基因上下游同源臂引物對分別是P1、P2 和P7、P8，nprE 基因上下游同源臂引物為P9、P10 和P15、P16。 PCR 擴增產物核酸膠回收后，用膠回收試劑盒純化并測定核酸濃度。

1.3.3 lox71-zeo-lox66 基因片段的擴增通過NCBI 網站查詢到p7Z6 質粒全基因序列，根據其中lox71-zeo-lox66 的基因序列， 設計引物擴增lox71-zeo-lox66。 PCR 體系中，模板為p7Z6，aprE 基因位點lox71-zeo-lox66 基因的引物為P3 和P4，nprE 基因位點lox71-zeo-lox66 基因的引物為P11 和P12。PCR 擴增產物核酸膠回收后，用膠回收試劑盒純化并測定核酸濃度。

1.3.4 HpaII-Mglu 基因片段的擴增根據HpaII和Mglu 基因的序列設計引物對擴增HpaII-Mglu 基因，PCR 體系中，模板為pMA5-HpaII-Mglu，aprE 基因插入位點HpaII-Mglu 基因的擴增引物為P5 和P6，nprE 基因插入位點HpaII-Mglu 基因的擴增引物為P13 和P14。PCR 擴增產物核酸膠回收后，用膠回收試劑盒純化并測定核酸濃度。

1.3.5 上下游同源臂、lox71-zeo-lox66 基因、HpaIIMglu 基因的融合4個基因片段的融合，參照兩步法融合方法[21]，操作具體如下：

第1 步PCR 體系如表2 所示：

PCR 條件：98 ℃預變性3 min；98 ℃解鏈8 s，61 ℃退火5 s，72 ℃延伸4 min，共13個循環；72 ℃保溫20 min。

表2 4 片段融合第1 步PCR 體系Table 2 First step PCR fusion consists of four segments

第2 步PCR 體系如表3 所示：

PCR 條件：98 ℃預變性3 min；98 ℃解鏈10 s，61 ℃退火15 s，72 ℃延伸4 min， 共28個循環；72 ℃保溫20 min。

表3 4 片段融合第2 步PCR 體系Table 3 Second step PCR confusion consists of four segments

1.3.6 B. subtilis 168 感受態制備及轉化將-40 ℃甘油管保存的B. subtilis168 在LB 固體瓊脂平板上劃線活化，37 ℃恒溫培養箱中培養12 h， 取單菌落接種于10 mL LB 液體培養基中，在37 ℃、180 r/min培養12 h。轉接200 μL 菌液于SPI 培養基中，37 ℃、180 r/min 培養5 h， 轉接1 mL 菌液于SPII 培養基中，37 ℃、180 r/min 培養1.5 h。 接著，于SPII 培養基中加入110 μL 100×EGTA，37 ℃、180 r/min 培養10 min。 所得菌液即為B. subtilis168 感受態細胞，將菌液分裝，500 μL 每管。轉化時加入重組DNA 片段， 輕輕振蕩混勻。 37 ℃、180 r/min 條件下培養90 min，涂布含有博萊霉素（25 mg/L）的LB 固體瓊脂平板，置于37 ℃恒溫培養箱中倒置培養12 h[22]。

1.3.7 抗性基因的敲除pTSC 質粒表達CRE 酶，會引導lox序列重組，消除抗性基因。 將上述方法得到的B. subtilis168 轉化子，再次制作成感受態。 將pTSC 質粒轉化入感受態細胞中，涂布到含有卡那霉素（100 mg/L）的固體LB 平板，37 ℃恒溫培養箱培養12 h。 將得到含有陽性轉化子在51 ℃恒溫培養箱中培養24 h，使溫度敏感型質粒pTSC 丟失。

1.3.8 重組B. subtilis 168 的構建按照上述方法制作B. subtilis168 感受態之后， 將得到的aprE、nprE 位點的融合片段分別轉化到B. subtilis168 感受態中，篩選到陽性轉化子，按照上述方法將抗性基因敲除后得到重組菌株BSM1 和BSM2。 接著，在BSM1 的基礎上， 將nprE 位點的融合片段轉化到BSM1 的感受態中，篩選到陽性轉化子，敲除抗性基因，得到BSM3。

1.4 重組B. subtilis 168 的發酵

將重組菌株分別在LB 平板上劃線， 挑選單菌落接種于10 mL LB 培養基中，37 ℃、180 r/min 培養12 h。將1 mL 菌液轉接入100 mL 發酵培養基中（500 mL 錐形瓶），于24 ℃、180 r/min 培養24 h。 收集得到的菌體用于酶活測定和SDS-PAGE 分析。

1.5 重組谷氨酰胺酶的蛋白純化及SDS-PAGE 分析

1.5.1 粗酶液的制取將發酵得到的菌體，10000 r/min 離心5 min 后收集菌體，用50 mmol/L 的Tris-HCl（pH 7.5）緩沖液洗滌2次后，用破碎緩沖液懸浮菌體。 加入溶菌酶 （終質量濃度為1 mg/mL），混勻，在4 ℃條件下放置2 h。 將離心管置于冰中，超聲破碎細胞，條件為：功率400 W，工作1 s 停2 s，總時間為5 min。 將破碎后的菌液，在4 ℃條件下，10000 r/min 離心20 min，獲得上清液。 將上清液用0.45 μm 濾膜過濾，即可得到粗酶液。

1.5.2 蛋白質純化將粗酶液用Ni-NTA 蛋白純化柱進行純化。 純化操作按照AKTA 蛋白純化儀說明書進行。上樣體積為5 mL，洗脫流量為0.5 mL/min。

1.5.3 谷氨酰胺酶的SDS-PAGE 分析分別吸取80 μL BSM3 重組菌株的純酶液、 粗酶液和B.subtilis168 的粗酶液，加入20 μL 5×Loading Buffer，混勻后煮沸20 min，進行SDS-PAGE 分析。 分離膠濃縮膠體積分數分別為12%和4%。 上樣量為15 μL。

1.6 酶活測定

本研究使用的是通過測定產物谷氨酸的含量[23]，進而測定谷氨酰胺酶酶活的方法。 具體如下：

酶活測定體系（1 mL）為：850 μL 用50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）溶解50 mmol/L 谷氨酰胺的底物溶液，37 ℃水浴鍋預熱5 min， 加入20 μL 粗酶液，對照加入100 μL 15 g/dL 的三氯乙酸，混勻后在37 ℃恒溫水浴鍋反應5 min， 迅速加入100 μL 15 g/dL的三氯乙酸并混勻， 對照加入20 μL 粗酶液并混勻，反應終止。 將反應液10000 r/min 離心10 min，以去除蛋白質，接著，取25 μL 反應液測定谷氨酸含量。 酶活定義：在37 ℃條件下，1 min 內反應生成1 μmol 的谷氨酸所需的酶量定義為一個酶活單位。

1.7 重組菌株的穩定性分析

單細胞微生物的生長繁殖，細胞呈現幾何級數2n增長，當n＝7 時，27＝128，將靜止期的菌液按體積分數1%接種量接種，再將其培養至靜止期，即可認為細胞已連續傳代7次[24-25]。 分別將BSM、BSM3 重組菌株在LB 瓊脂平板上劃線，37 ℃恒溫培養箱培養12 h。 接著，分別挑選BSM、BSM3 重組菌株單菌落接種至LB 液體培養基中，37 ℃、180 r/min 條件下培養12 h，作為種子液。分別將1 mL 菌液轉接至100 mL 發酵培養基（500 mL 錐形瓶），24 ℃、180 r/min條件下培養24 h 后，分別取樣測酶活，同時繼續將1 mL 菌液轉接至100 mL 新鮮發酵培養基（500 mL錐形瓶）。 依此類推，每隔24 h 取樣測定酶活，共測定6次。

1.8 重組菌BSM35 L 發酵罐發酵水平分析

將重組菌株BSM3 在LB 固體平板劃線，37 ℃恒溫培養箱培養12 h。挑取單菌落接種至10 mL LB培養基中，37 ℃、180 r/min 條件下培養12 h。 吸取1 mL 菌液轉接于100 mL LB 培養基中 （1000 mL錐形瓶），37 ℃、180 r/min 條件下培養10 h，作為種子液。 接著將種子液全部轉接進5 L 發酵罐中（2 L發酵培養基），控制條件：溫度為24 ℃，pH 為7.0（體積分數50%磷酸和50%氨水控制）、轉速為450 r/min。

2 結果與討論

2.1 重組菌株構建

重組菌株構建過程，見圖1，我們根據上述方法擴增出了各個片段（見圖2），并構建了2個蛋白酶基因位點的融合片段 （見圖3）， 并成功轉化入B.subtilis168 感受態中，通過博萊霉素抗生素平板篩選到陽性轉化子，接著用pTSC 質粒去除抗性基因，成功得到無抗性基因的重組菌株BSM1 和BSM2。在重組菌株BSM1 的基礎上，在nprE 基因位點插入Mglu基因，去除抗性基因后，得到重組菌株BSM3。通過增加谷氨酰胺酶基因Mglu的整合表達位點，可能能解決單拷貝基因表達產物低的問題。

圖1 Mglu 基因整合入B. subtilis 168 染色體DNA 過程示意圖Fig. 1 Strategy for integrating Mglu gene in B. subtilis 168 chromosome DNA

一個融合片段包括兩段同源臂、HpaII-Mglu基因和lox71-zeo-lox66 基因。 由于同源區域的存在，B. subtilis168 染色體DNA 會在敲除基因（aprE 或nprE）的同時，引入HpaII-Mglu基因和lox71-zeolox66 基因。 接著，會通過CRE/loxp系統敲除lox71序列和lox66 序列之間的zeo抗性基因， 并形成了lox72 序列。

圖2 lox71-zeo-lox66、HpaII-Mglu 和上下游同源臂片段的PCR 電泳圖Fig. 2 PCR electrophoresis of lox71-zeo-lox66，HpaIIMglu and two homologous arm segments

圖3 融合片段PCR 電泳圖Fig. 3 PCR electrophoresis of fusion segaments

2.2 重組菌株的發酵酶活對比

為了探究不同重組菌株的谷氨酰胺酶表達水平， 按照上述方法對菌株B. subtilis 168、BSM1、BSM2、BSM3 進行發酵培養。 如圖4 所示，重組菌株的生長趨勢和野生型菌株B. subtilis 168 趨勢基本保持一致， 在18 h 時達到最大菌濃，OD600為9 左右。 重組菌株的最大發酵酶活如圖5 所示，野生型菌株B. subtilis 168 無谷氨酰胺酶酶活， 重組菌株BSM1、BSM2 和BSM3 的最大發酵酶活分別為0.5、0.6 U/mL 和1.0 U/mL。 重組菌株BSM1 和BSM2 中Mglu 基因的拷貝數都是1， 但BSM2 相對于BSM1的谷氨酰胺酶酶活要高，原因可能是中性蛋白酶對表達的谷氨酰胺酶降解量更多，將其敲除之后更有利于谷氨酰胺酶的表達。很顯然，重組菌株BSM3 的發酵酶活最高， 重組菌株BSM3 相對于BSM1 酶活提高了100%（圖5）。使用整合表達外源基因可以避免游離質粒表達分離不穩定的問題，但是目的基因表達量低成為整合表達的一大障礙。 我們可以通過增加整合表達位點和敲除內源性蛋白酶的方法增加目的蛋白基因的表達量。

圖4 重組菌株生長曲線Fig. 4 Growth curve of recombinant strains

2.3 重組谷氨酰胺酶的蛋白質純化

圖5 重組菌株和B. subtilis 168 最大發酵酶活對比分析Fig. 5 Maximum fermentation glutaminase activities of the recombinant strains and B. subtilis 168

在重組菌株構建過程中，Mglu 基因前面3’端添加了His-tag 序列，所以可以通過Ni2+親和層析分離出谷氨酰胺酶。 純化后的谷氨酰胺酶的SDSPAGE 電泳圖如圖6 所示，以B. subtilis 168 作為陰性對照， 粗酶液和純酶液在大約4.8×104位置有一條明顯的條帶。 酶活測定可知，BSM3 表達的谷氨酰胺酶比酶活為1326 U/mg，大小基本與報道一致[2]。

圖6 重組菌株BSM3 表達谷氨酰胺酶SDS-PAGE 電泳圖Fig. 6 SDS -PAGE analysis of the expression of glutaminase in BSM3

2.4 重組菌株BSM3 的遺傳穩定性分析

整合型菌株的遺傳穩定性是衡量工業生產菌株的一個重要因素。 相對于游離質粒表達，整合表達可以提高外源基因的遺傳穩定性。 在無抗生素條件下， 我們通過連續轉接重組菌株并測定酶活，分析重組菌株的遺傳穩定性，結果如圖7 所示，重組菌株BSM3 在連續傳代42次之后， 酶活依然穩定，遺傳穩定性較好。 然而，游離質粒表達Mglu 基因重組菌株BSM 在連續傳代14次之后，酶活明顯下降，遺傳穩定性很差。 微生物使用游離質粒過表達谷氨酰胺酶的優勢很明顯，可以大大地提高酶活。 但是，質粒的分離穩定性很差，被認為是其表達的一大問題，限制了在工業中的應用。 所以，整合型表達谷氨酰胺酶菌株BSM3 更適合工業生產。

圖7 重組菌株BSM3、BSM 遺傳穩定性分析Fig. 7 Analysis of genetic stability of the recombinant strains BSM3 and BSM

2.5 5 L 發酵罐的分批補料發酵

由于搖瓶發酵營養物質有限，限制了重組菌株BSM3 的生物量，為了提高谷氨酰胺酶的產量，我們選擇使用5 L 發酵罐進行分批補料發酵。 結果如圖8 所示，重組菌株BSM3 在7 h 左右時進入對數期。在32 h 左右時，OD600達到了最大，約為92。 我們發現，產酶曲線和生長曲線存在一定的相關性。 酶活在32 h 左右是達到了最大，為41.5 U/mL。 32 h 之后，谷氨酰胺酶酶活有逐漸降低的趨勢，這可能是因為該谷氨酰胺酶不穩定，發生了變性，導致酶活降低。

圖8 重組菌株BSM35 L 發酵罐發酵水平分析Fig. 8 Fed-batch fermentation of the recombinant strain BSM3

3 結 語

本實驗構建穩定的重組谷氨酰胺酶表達菌株，選擇對B. subtilis 168 進行定點整合，來表達谷氨酰胺酶，提高Mglu 基因的遺傳穩定性。 增加基因表達產物活性可以通過在基因上游插入強啟動子、增加結構基因拷貝數、對結構基因進行改造、降低降解或抑制表達產物活性物質的表達等方式進行。 本實驗中在使用強啟動子HpaII 的基礎上， 在敲除2個內源性蛋白酶基因aprE、nprE 的同時， 插入谷氨酰胺酶基因。 既增加了谷氨酰胺酶的拷貝數，又降低了蛋白酶對表達產物谷氨酰胺酶的降解。 通過對比發現，增加谷氨酰胺酶基因拷貝數，可有效提高谷氨酰胺酶表達水平。 本實驗中采用lox 序列重組的方式將Mglu 基因整合到B. subtilis 168 染色體上，抗性基因也插入到了染色體上， 表達pTSC 質粒上重組酶CRE，引導lox 序列重組，消除抗性基因，因此， 該重組表達谷氨酰胺酶菌株BSM3 可直接用于食品發酵。