脅迫條件下褪黑素誘導雨生紅球藻蝦青素合成

崔 靜， 李 濤， 丁 巍， 趙永騰， 余旭亞

（昆明理工大學 生命科學與技術學院，云南 昆明650500）

蝦青素具有淬滅單線態(tài)氧的能力，是一種具有強抗氧化特性的萜類化合物，被作為添加劑廣泛應用于食品和水產生物的養(yǎng)殖中[1-2]。 在脅迫條件下，雨生紅球藻會大量合成蝦青素，被公認為是天然蝦青素的最佳生物來源[3-4]。 蝦青素作為一種具有強抗氧化特性的物質，其生物合成是雨生紅球藻抵抗生物或非生物脅迫的一種防御作用[5-6]。 雨生紅球藻中蝦青素含量的積累，對提高其響應外界脅迫的防御作用尤為重要。

MLT 是一種新的植物生長調節(jié)劑和抗氧化劑，可提高植物對各種生物和非生物脅迫的耐受性[7]。Shi 等[8]的研究顯示，外源添加MLT 處理病原菌Pst DC3000 侵染的擬南芥葉片，可增加NO 生成及SA相關基因的表達，增加對病原菌的抗性。 雨生紅球藻作為一種真核單細胞綠藻， 在脅迫條件下，MLT對蝦青素積累的作用，及其與藻細胞內信號分子之間的相互作用仍未見報道。

包括微藻在內的真核生物中，在外部環(huán)境刺激下，各種信號通路會開啟或關閉，并逐級放大或相互關聯，從而調控生物體內的復雜生理活動。 NO 作為一種多用途的細胞信號效應器，它在不同的代謝過程中起著重要作用， 如抗生物和非生物脅迫，調節(jié)激素信號傳導等[9]，是生物體內一種重要的信號分子。 有絲分裂激活蛋白激酶（MAPK）信號通路，在各種真核生物的復雜生理活動中扮演著重要的角色，NO 和MAPK 信號通路對調節(jié)多種細胞功能發(fā)揮了核心作用[10]，但是在微藻中，關于這些信號級聯的作用鮮有研究。

作者旨在缺氮聯合高光照條件下，外源添加MLT 誘導雨生紅球藻積累蝦青素，初步闡明MLT對雨生紅球藻應激反應的調控作用。并利用小分子抑制劑的化學遺傳學，研究了MLT 調控NO 介導的MAPK 信號傳導途徑對雨生紅球藻中蝦青素積累的影響。

1 材料與方法

1.1 雨生紅球藻的培養(yǎng)和誘導

雨生紅球藻Haematococcus pluvialis LUGU 由云南瀘沽湖水樣中分離純化所得[11]。以BBM 為基礎培養(yǎng)基，于3 L 鼓泡式光生物反應器（直徑0.2 m，高0.3 m）中培養(yǎng)，（其中含2 L BBM 培養(yǎng)基），并以0.1 vvm 的速度通入無菌空氣，光照強度為2800 lx，培養(yǎng)溫度（25±1） ℃，培養(yǎng)到對數后期（大約9.0×105cells/mL）。

3800g 離心5 min，無菌水洗滌2次，以去除殘留的營養(yǎng)物質。 將所獲的藻液沉淀，重新懸浮至缺氮的BBM（500 mL 錐形瓶，其中含360 mL 培養(yǎng)基）培養(yǎng)基中，最初的細胞濃度調整為2×105cells/mL。將不同的化學小分子加入到缺氮BBM 培養(yǎng)基中（表1）。將未經處理的藻細胞培養(yǎng)作為對照組。每組設3個平行樣。以0.4 vvm 的速度通入無菌空氣，光照10000 lx，溫度保持在（28±1） ℃，室內培養(yǎng)13 d。

表1 誘導蝦青素生物合成不同誘導子的處理濃度Table 1 Concentration of different treatments used for the induction of astaxanthin biosynthesis

1.2 藻細胞生物量、蝦青素的測定

為測定Haematococcus pluvialis LUGU 的干細胞質量（DCW），每隔4 天取10 mL 誘導藻液，并3800 g 離心5 min， 所獲沉淀用蒸餾水洗滌2次，離心、收集、置于EP 管中，儲存于-20 ℃，冷凍干燥并測定質量。

利用高效液相色譜（HPLC）測定蝦青素含量。取各干燥樣品10 mg，充分研磨，然后用丙酮∶氯仿（1∶1，V/V） 溶液提取干藻粉中蝦青素，4 ℃條件下，12000 g 離心5 min。 多次重復此過程，至藻細胞呈白色。 將提取后的溶液置于45 ℃真空干燥箱完全干燥。 隨后用1 mL 甲醇∶二氯甲烷（3∶1，V/V）溶液溶解干燥的提取物，HPLC 上樣檢測。 其中，HPLC 條件為：流動相A 為丙酮，流動相B 是體積比為9∶1 的甲醇∶水； 洗脫梯度為：B 80%～20%25 min，B 20% 10 min，B 20%～80% 15 min，進樣量20 μL， 流速為1.25 mL/min。 光譜掃描波長范圍為250～700 nm，檢測波長為476 nm。 用液相色譜標準曲線計算蝦青素質量濃度c（mg/L），蝦青素質量分數為：

其中，P 為蝦青素質量分數，（mg/g）；DCW 為干細胞質量濃度，（g/L）。

1.3 藻細胞內NO 的檢測

用雙胺熒光素（DAFM-FM DA）檢測NO 水平[12]。將新鮮藻細胞（1×106cells/mL）離心、洗滌，加入5 μmol/L DAF-FM DA，避光、恒溫37 ℃條件下，置于HEPES/PBS 緩沖液（pH 7.4）中振蕩孵育20 min。 離心、洗滌，利用激光掃描共聚焦顯微鏡采集藻細胞熒光圖片； 熒光分光光度計檢測微藻細胞熒光強度，計算NO 含量。

1.4 總蛋白質提取和蛋白免疫印跡

取新鮮藻液5 mL，3500 g 離心10 min，將沉淀物懸浮于Tris 緩沖鹽溶液 （TBS， 濃度50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4， 濃度150 mmol/L NaCl，pH 7.5）中。 12000 g 離心5 min，并將沉淀物加入含有濃度1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0），體積分數0.2%聚乙烯吡咯烷酮， 體積分數2.0% 2-巰基乙醇，1 mmol/L EDTA，10 mmol/L 磷酸酶抑制劑復合物I 和1 mmol/L PMSF 的提取液中。 4 ℃勻漿研磨，12000 g 離心30 min 得到總蛋白質提取液。 根據Bradford[13]法測定上清液中總蛋白質的含量。上清液儲存于-80 ℃。

樣品蛋白質通過質量分數12% SDS-PAGE 分離并轉移至硝酸纖維素膜。 將膜置于5 g/dL 脫脂奶粉TBST 溶液中封閉1 h， 然后放入含有p38MAPK抗體的抗血清溶液中4 ℃孵育過夜后， 用TBST 洗滌， 隨后用1∶1000 稀釋度的抗兔免疫球蛋白G 的辣根過氧化物酶綴合的抗體孵育2 h[14-15]。 通過使用增強的化學發(fā)光底物檢測試劑盒使抗原抗體復合物可視化，進而得到MAPK 蛋白質表達量。

1.5 RNA 提取及基因表達量的檢測

使用TriZol 試劑提取總RNA。利用RT-PCR 試劑盒（TaKaRa）對1 μg RNA 進行反轉錄，然后進行qRT-PCR 擴增，使用ABI 7500 熒光定量儀分析dxs和chy 相對轉錄水平。表2 為內參基因18 S 和dxs、chy 的熒光定量引物。 其中內參基因的作用即作為內標以調節(jié)RNA 的用量和循環(huán)數， 使內標基因在誘導條件下的表達豐度一致。qRT-PCR 數據結果用2-ΔΔCt[16]的方法進行分析。

1.6 統(tǒng)計分析

每組試驗設置3個平行。 采用ANOVA（SPSS 20.0）一步法分析所得試驗數據。最小顯著性差異進行多重比較檢驗，分析不同試驗的組間差異，當p＜0.05 時具有顯著性意義，p＜0.01 具有極顯著性意義。

表2 酶基因熒光定量引物Table 2 Primers of Enzyme genes for qRT-PCR

2 結果與討論

2.1 不同處理對雨生紅球藻生物量和蝦青素積累的影響

不同誘導方法對雨生紅球藻生物量和蝦青素積累的影響見圖1，隨著培養(yǎng)時間的延長，所有實驗組的生物量呈上升趨勢。經過13 d 的培養(yǎng)，對照組、MLT 組和SNP 組的生物量分別達到了0.61、0.59、0.70 g/L。 MLT 結合cPTIO 組和MLT 結合U0126 組的雨生紅球藻生長受到抑制，與對照組相比，生物量分別降低22.95%和26.23%。

生物量增加的同時，蝦青素的質量分數在所有實驗組中也顯示出不同程度的提高。 如圖1 （b）所示，在0～13 d 培養(yǎng)過程中，對照組蝦青素的質量分數為14.36 mg/g。 在外源添加MLT 后，細胞內的蝦青素質量分數迅速增加至32.37 mg/g， 與對照組相比，增加了2.25 倍。 在SNP 誘導組中，蝦青素質量分數也明顯比對照組更高， 并在13 d 后達到峰值19.69 mg/g。 相比之下，cPTIO 和U0126 的預處理導致了蝦青素的積累減少， 最高質量分數分別為11.04 mg/g 和9.03 mg/g。

圖1 不同處理對再生紅球藻生物量和蝦青素質量分數的影響Fig. 1 Effects of different treatments on biomass and astaxantin content of H.plunalis

2.2 不同誘導方法對雨生紅球藻細胞內NO 水平的影響

生物體內，NO 是參與多種生理活動的信號分子。為了確定MLT 對蝦青素積累的調控機制是否依賴NO 對脅迫的反應，應用MLT、SNP（NO 供體）和MLT 結合cPTIO （NO 消除劑）3 種處理方式處理雨生紅球藻，另設有對照組。不同誘導方法對雨生紅球藻細胞內NO 水平的影響如圖2 所示。 相比對照組，MLT 處理組和SNP 處理組的NO 水平顯著增加，而MLT 結合cPTIO 處理組細胞內NO 水平顯著降低。

圖2 不同處理對雨生紅球藻細胞內NO 水平的影響Fig. 2 Effects of different treatments on nitric oxide levels in H.pluvialis

2.3 不同誘導方法對雨生紅球藻細胞內MAPK 的影響

MAPK 是將細胞外刺激信號轉換成細胞內反應的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在許多真核生物的生理過程中發(fā)揮著重要的細胞信號傳導作用，參與細胞內多種代謝過程[17]。 Western blotting 檢測MAPK表達水平的結果如圖3 所示。 當利用不同化學分子誘導藻細胞后，在第5 天MAPK 的含量顯示出顯著差異。 相比對照組，MLT 誘導組和SNP 誘導組的MAPK 水平顯著提高， 而MLT 結合cPTIO、MLT 結合U0126 處理組的MAPK 表達水平被明顯抑制。至第13 天，與第5 天的水平相比，所有組的MAPK 含量均增加；相比之下，MLT 結合U0126 組，MAPK 水平仍然低于其他組，蝦青素的合成也受到抑制（圖1（b）），源于U0126 對MAPK 的抑制作用。

圖3 不同處理對雨生紅球藻細胞內MAPK 的影響Fig. 3 Effects of different treatments on MAPK in H.pluvialis cells

2.4 不同誘導方法對雨生紅球藻蝦青素積累相關基因轉錄水平的影響

環(huán)境脅迫條件下，外源化學物質或植物激素的添加，可調節(jié)微藻中與蝦青素生物合成相關基因的表達量[18]。為了確定缺氮聯合高光條件下，MLT 對雨生紅球藻蝦青素合成相關基因轉錄水平的影響，借助實時熒光定量PCR，在誘導5 d 和13 d，對藻細胞蝦青素合成關鍵基因dxs 和chy 的表達水平進行檢測、分析。 圖4 顯示，第5 天的cPTIO 誘導組中，上述2 種基因表達水平均相對較低。 在第13 天，MLT 誘導組和SNP 誘導組，dxs 和chy 的轉錄水平與對照相比均表現出顯著性增加，達到最大轉錄水平。 其中，在MLT 處理組與對照組相比，dxs 和chy的最大轉錄水平分別提高了1.95 和1.74 倍；在SNP 組，dxs 和chy 的最大轉錄水平均是對照組的1.32 倍。 然而，在cPTIO 誘導組中，2 種基因的轉錄水平均顯著降低。

2.5 討論

研究表明，在脅迫條件下，雨生紅球藻會大量積累蝦青素，生物量也會受到一定影響[19]。在本研究中，MLT 誘導組生物量與對照組相比， 沒有顯著差異。 這一結論與之前的研究結果相似，強光照條件下添加MLT 可以抑制萊茵衣藻生物量的降低[20]。 周永斌等[21]發(fā)現SNP 對種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率及幼苗的根長、 葉綠素含量和生物量有明顯的促進作用，且Giba 等[22]也發(fā)現NO 消除劑可抑制皇后樹種子萌發(fā)而SNP 則促進種子萌發(fā)。 由于藻類和植物的相似性，我們的結果也與之相似，作為NO 的供體，SNP的添加促進了雨生紅球藻的生長，生物量質量濃度達到了0.70 g/L；NO 清除劑-cPTIO 的添加和MAPK抑制劑-U1026 的添加均抑制了雨生紅球藻的生長。

圖4 不同處理對dxs、chy 轉錄水平的影響Fig. 4 Effects of different treatments on the transcription level of dxs，chy

一些化合物， 作為代謝的啟動因子或增強子，能夠直接調節(jié)細胞代謝，可以應用于雨生紅球藻以促進蝦青素的積累[23-24]。 近年的研究表明，茉莉酸（JA）、水楊酸（SA）、赤霉酸（GA3）、脫落酸（ABA）、黃腐酸（FA）和2，4-表油菜素內酶（EBR）均可以增強蝦青素的積累[25-26]。 MLT 作為一種信號分子和抗氧化劑，其外源添加也顯著促進了雨生紅球藻蝦青素含量。 在脅迫條件下，MLT 可能是以增強雨生紅球藻中蝦青素積累的方式響應外界刺激，提高雨生紅球藻對外界脅迫的抵御能力。 另外，SNP 誘導組的蝦青素含量得到提升，MLT 結合cPTIO 和U0126的處理導致了蝦青素的積累減少，推測蝦青素的積累可能與藻細胞內NO 水平有關， 而NO 作為信號分子可能是通過激活了MAPK 信號通路從而提高了蝦青素積累量[27]。

通過測定雨生紅球藻細胞內的NO 含量， 發(fā)現MLT 處理組和SNP 處理組的NO 水平提高，MLT 結合cPTIO 處理組細胞內NO 含量顯著降低，相應地，蝦青素積累量也顯著降低（圖1（b））。這一結果表明蝦青素的積累與藻細胞內NO 水平有關，且MLT 調控雨生紅球藻對外界脅迫的作用依賴于NO 的介導。

為了驗證NO 作為信號分子是否通過激活MAPK 信號通路，從而提高蝦青素積累量，即MAPK是否為NO 在藻細胞中的一個重要靶點， 本研究借助Western blotting 檢測了MAPK 的表達水平。結果表明，MAPK 抑制組中，MAPK 含量顯著低于對照組，蝦青素的合成受到抑制（圖1（b））。 NO 清除組中，MAPK 水平沒有受到抑制，蝦青素合成同樣受到抑制（圖1（b）），表明藻細胞內NO 水平可通過影響MAPK 含量影響雨生紅球藻中蝦青素的積累。

Neill[28]和Asai[29]的研究結果顯示，NO 信號的傳遞與MAPK 信號通路有關，如：NO 處理能誘導擬南芥懸浮細胞4.7×104的MAPK 活性增高。 Pagnussat等[30]的研究也表明，外源NO 和生長素誘導黃瓜不定根形成過程中激活了4.8×104MAPK 活性，而NO清除劑-cPTIO 不僅能抑制該激酶活性的增加，而且能抑制外源NO 和生長素對不定根形成的誘導作用，證明了NO 激活MAPK 信號通路是生長素誘導不定根形成必需的。

Shi 等[31]發(fā)現MLT 可誘導高水平的NO 刺激防御相關基因的表達， 而NO 清除劑可抑制煙草和擬南芥中防御相關基因的表達。 本研究的結果與此一致，在脅迫條件下，外源MLT 的添加，提高了雨生紅球藻細胞內的NO 水平， 激活了依賴于NO 的MAPK 信號通路， 蝦青素的積累作為雨生紅球藻響應外界刺激，提高其對外界脅迫的方式，蝦青素合成關鍵酶基因的表達水平得到上調，從而提高了蝦青素積累量。 在許麗麗等[32]的RNA-Seq 分析表明，MLT 的處理使葡萄果實中有30個sts 基因表達上調，提高了葡萄果實和根系中白藜蘆醇的含量。

3 結 語

綜上，可提出一種褪黑素誘導蝦青素高效合成的信號通路模型（見圖5）。 高光照、氮缺陷條件下，外源添加MLT 提高了雨生紅球藻細胞內的NO 水平，激活了依賴于NO 的MAPK 信號通路，上調了蝦青素合成關鍵酶基因dxs 和chy 的表達水平，進而促進了蝦青素的大量積累。 實驗證實了在雨生紅球藻中MAPK 是NO 作用的一個靶點，這為基因工程改造雨生紅球藻以提高蝦青素產量提供了科學的依據，對進一步研究雨生紅球藻高效合成蝦青素具有一定的理論和實踐意義。隨著MLT 誘導雨生紅球藻蝦青素生物合成體系的建立和信號轉導調控的進一步研究，分子水平調控雨生紅球藻蝦青素合成將為蝦青素生產提供一種有效策略。

圖5 褪黑素誘導雨生紅球藻在脅迫條件下積累蝦青素的信號通路假設模型示意Fig. 5 Schematic diagram of the signal pathway hypothesis model for the accumulation of astaxanthin in Haematococcus pluvialis induced by melatonin under stress