福建黃兔線粒體基因組全序列測定與分析

周 彤，周 娟，梁 爽，鮑志遠(yuǎn)，趙博昊，胡帥帥，陳 陽，吳信生

(揚州大學(xué) 動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚州 225009)

絕大多數(shù)動物線粒體DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)為閉合的雙鏈環(huán)，長度為16～17.5kb，基因組排列緊湊，每個細(xì)胞含有成千上萬個線粒體基因組 DNA 拷貝，結(jié)構(gòu)基本一致[1]。線粒體DNA與核基因相比具有結(jié)構(gòu)簡單保守、母系遺傳、無組織特異性、多拷貝和進(jìn)化速度快的特征，在研究親緣關(guān)系和物種進(jìn)化等方面具有重要價值[2]。探究動物線粒體DNA的結(jié)構(gòu)特征，可以為鑒定物種的起源與進(jìn)化提供非常重要的資料與參考。童曉梅等[3]分析藏雞mtDNA部分序列，發(fā)現(xiàn)藏雞與家雞都起源于紅原雞，并歸屬于紅原雞種；汪琦等[4]通過構(gòu)建牛亞科代表性品種mtDNAD-loop序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹，揭示了三江黃牛與秦川牛、平武牛親緣關(guān)系較近；王洪亮等[5]基于線粒體DNA4個基因序列對矮小梅花鹿群體進(jìn)行起源進(jìn)化分析，認(rèn)為該矮小群體有3個母系起源。福建黃兔為原產(chǎn)于福建的家兔品種，因毛色獨特、耐粗飼、適應(yīng)性強和藥用價值高而素有“藥膳兔”之稱，是目前中國保存與開發(fā)利用最好、種群最大的地方品種[6]。福建黃兔肉品質(zhì)優(yōu)良、藥用價值高，因此研究主要集中在生長發(fā)育與肉質(zhì)特性等方面[7-10]，而針對福建黃兔起源和遺傳特性的研究相對較少，俞春英等[11]利用15個微衛(wèi)星位點分析了福建黃兔群體的遺傳多態(tài)性；趙紀(jì)萍[12]基于6個地方家兔品種SNPs信息對福建黃兔的遺傳地位進(jìn)行了初步分析。因此，本研究對福建黃兔的mtDNA進(jìn)行全序列測定與結(jié)構(gòu)分析，以期為福建黃兔的物種分類、種質(zhì)鑒定和資源保護(hù)提供可靠資料。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

江蘇省金陵種兔場提供6只健康成年福建黃兔，耳中央動脈采血，EDTA試劑抗凝，2～10 ℃條件下帶回實驗室，于-80 ℃超低溫冰箱保存，待用。

1.2 基因組DNA提取

利用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒(TIANGEN，北京)提取基因組DNA，使用Nanodrop 1000測定樣品的質(zhì)量濃度和純度，選留高純樣品。

1.3 引物設(shè)計與PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank公布的近緣物種穴兔的mtDNA全序列(GenBankNo. AJ001588.1)，利用Premier 6.0設(shè)計12對覆蓋福建黃兔線粒體基因組全部序列的特異性引物，引物信息參表1。由擎科生物技術(shù)(南京)有限公司進(jìn)行引物合成，PCR擴(kuò)增體系(50 μL)：2×Phanta Max Buffer 25 μL，dNTP Mix(10 mmol/L each) 1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，模板DNA(50～400 ng/μL)1 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Ploymerase 1 μL，ddH2O 18 μL。引物P1、P2、P3、P4、P5、P6、P8、P9、P10、P12的PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，63 ℃復(fù)性30 s，延伸3 min，34個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。引物P7和P11的PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性 3 min；95 ℃變性15 s，59 ℃復(fù)性15 s，72 ℃延伸 3 min，34個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物送華大基因公司測序。高保真DNA聚合酶等PCR擴(kuò)增試劑購于諾唯贊生物科技(南京)有限公司，膠回收試劑盒購于寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限 公司。

表1 福建黃兔線粒體基因組序列擴(kuò)增引物信息Table 1 Mitochondrial genome primer information of Fujian Yellow Rabbit

1.4 序列拼接、注釋與分析

利用SeqMan 7.0軟件對測序結(jié)果進(jìn)行比對、拼接和校正，得到福建黃兔線粒體基因組全序列。利用Clustal X、tRNA scan-SE和MegAlign等軟件對基因組序列的結(jié)構(gòu)特點進(jìn)行分析，包括各基因的位置與大小、堿基組成與偏倚度、tRNA二級結(jié)構(gòu)、氨基酸偏好性等。使用OGDRAW在線軟件進(jìn)行福建黃兔線粒體基因組圖譜的繪制。用MEGA 7.0軟件將其他序列與福建黃兔基 因組相應(yīng)序列進(jìn)行多序列比對后構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn) 行樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 線粒體基因組的結(jié)構(gòu)特征

經(jīng)比對拼接，福建黃兔線粒體基因組全序列長度為17 000 bp，包括tRNA基因22個、蛋白編碼基因13個、rRNA基因2個和控制區(qū)1個，基因排列順序同其他兔種基本一致(圖1，表2)，將序列提交至GenBank(No.MN518689)。蛋白編碼基因(長度為11 391 bp)、tRNA基因(長度為 1 505 bp)、rRNA基因(長度為2 536 bp)和控制區(qū)(長度為1 555 bp)分別占整個線粒體長度的 67.00%、8.85%、14.92%和9.15%。37個編碼基因中的9個基因[tRNA-Glu、tRNA-Gln、tRNA-Cys、tRNA-Asn、tRNA-Tyr、tRNA-Ala、tRNA-Ser(UCN)、tRNA-Pro]由輕鏈(L鏈)編碼，其余28個編碼基因由重鏈(H鏈)編碼。其堿基含量為:A(31.41%)>T(28.18%)>C (26.70%)>G(13.71%)，A+T含量 (59.59%)高于C+G含量(40.41%)。基因間無內(nèi)含子，基因排列緊密，全序列共有12處間隔區(qū)域和5處重疊區(qū)域，最大間隔區(qū)域(8 bp)位于tRNA-Gln和tRNA-Met之間，最大重疊區(qū)域 (43 bp)位于ATPase8和ATPase6之間。

圖1 福建黃兔線粒體基因組序列結(jié)構(gòu)圖譜Fig.1 Sequence map of mitochondrial genome of Fujian Yellow Rabbit

表2 福建黃兔線粒體基因組結(jié)構(gòu)Table 2 Mitochondrial genome structure of Fujian Yellow Rabbit

(續(xù)表2 Continued table 2)

2.2 蛋白編碼基因

福建黃兔線粒體基因組的蛋白編碼基因有13個，包括1個CYTB基因、2個ATPase(ATPase8和ATPase6)、3個氧化酶亞基(COX1、COX2和COX3)和7個脫氫酶亞基(NADH1、NADH1-2、NADH1-3、NADH1-4L、NADH1-4、NADH1-5和NADH1-6)，使用了3種起始密碼子和4 種終止密碼子，NADH2和DNAH5使用ATT起始密碼子，NADH3使用ATA起始密碼子，其余10個蛋白編碼基因均使用ATG作為起始密碼子，終止密碼子以TAA(8個)為主，其次為TAG、AGG和AGA 3種終止密碼子。

13個蛋白編碼基因除終止密碼子外共編碼 3 787個密碼子，使用頻率最高的密碼子為UUU(Phe)、CUA(Leu)、AUU(Ile)和AUA(Met)。利用MEGA 7.0軟件分析密碼子使用情況(表3)，發(fā)現(xiàn)福建黃兔線粒體編碼基因中有CUA、UCA、UGA、CGA等34個偏好密碼子(RSCU≥1)；密碼子第1 位堿基偏倚度最小，T1s、C1s、A1s、G1s( A、T、G、C含量在密碼子第3 位堿基總量中所占比)分別為22.40%、24.70%、 31.10%、21.90%；T3s、C3s、A3s、G3s分別為 26.00%、29.90%、37.50%、3.50%，A3s大于T3s、C3s、G3s，表明福建黃兔蛋白編碼基因偏好使用以堿基A結(jié)尾的密碼子。

2.3 基因組tRNA和rRNA

福建黃兔線粒體基因組的14個tRNA位于H鏈上，8個tRNA位于L鏈，共22個tRNA。其中tRNA-Leu和tRNA-Ser分別擁有兩種反密碼子。對tRNA二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，21種tRNA均可折疊形成三葉草結(jié)構(gòu)，僅tRNA-Ser(AGY)因為DHU臂缺失而不能正確進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)的折疊，在對應(yīng)位置上形成一個環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這與已公布的其他兔形目動物tRNA-Ser(AGY)的結(jié)構(gòu)一致。其中，12S rRNA和16S rRNA兩基因間相距66 bp，被tRNA-Val隔開，序列長度分別為957 bp、1 579 bp，A、T、A+T含量分別為 35.84%、23.93%、59.77%和36.35%、25.49%、 61.81%，A+T偏度分別為0.199 3和0.176 2。

表3 福建黃兔線粒體基因組的密碼子使用頻率Table 3 Codon usage frequency of mitochondrial genome in Fujian Yellow Rabbit

2.4 L-鏈復(fù)制起始區(qū)和控制區(qū)

福建黃兔線粒體基因組中包括L鏈復(fù)制起始區(qū)(WANCY區(qū))和控制區(qū)(D-loop區(qū))兩段非編碼區(qū)域。L鏈復(fù)制起始區(qū)位于WANCY(tRNA-Trp、tRNA-Ala、tRNA-Asn、tRNA-Cys和tRNA-Tyr)基因簇之間，長度為35 bp，該段序列堿基的保守性很強，折疊后形成穩(wěn)定的莖-環(huán) 結(jié)構(gòu)。

福建黃兔控制區(qū)長度為1 555 bp，在tRNA-Pro和tRNA-Phe之間，含有較多的重復(fù)序列，是基因組中長度變化最大的部分。控制區(qū)包含3 個結(jié)構(gòu)域(圖2)：延長終止序列區(qū)(ETAS)、中央保守區(qū)(CCSB)和保守序列區(qū)(CSB)，分別位于1～383 bp、384～701 bp和702～1 555 bp。延長終止序列區(qū)中包含兩個參與重鏈復(fù)制與終止的序列(ETAS1和ETAS2)。比對多個物種的控制區(qū)結(jié)構(gòu)信息，識別出3 段保守序列(CSB1～3)和2 組串聯(lián)重復(fù)序列(短重復(fù)序列RS3和長重復(fù)序列RS2)。RS3在CSB1和CSB2之間，包含10個拷貝的20 bp長的序列(short repeat, SR)；RS2在CSB3 和tRNA-Phe之間，包含2個拷貝的153 bp長的序列(long repeat, LR)。SR表現(xiàn)出重復(fù)cbabc基序的內(nèi)部結(jié)構(gòu)， a=ACCC，b=GTAC， c=GCAC，此外，緊鄰RS3序列處存在88 bp SR結(jié)構(gòu)的重排序列。

2.5 系統(tǒng)進(jìn)化分析

將福建黃兔線粒體基因組D-loop區(qū)與韓國野兔(Lepuscoreanus)、雪兔(Lepustimidus)、格拉納達(dá)野兔(Lepusgranatensis)、草兔(Lepuscapensis)、華南兔(Lepussinensis)、美洲兔(Lepusamericanus)、海南兔(Lepushainanus)、高原鼠兔(Ochotonacurzoniae)和柯氏鼠兔(Ochotonakoslowi)9種兔形目動物線粒體D-loop區(qū)進(jìn)行多重序列比對與分析，以柯氏鼠兔和高原鼠兔兩種兔形目鼠兔科動物為外群，利用MEGA 7.0軟件的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析福建黃兔的進(jìn)化關(guān)系與分類地位(圖3)。發(fā)現(xiàn)該進(jìn)化樹由兩大支構(gòu)成，鼠兔科的柯氏鼠兔和高原鼠兔聚為一支，韓國野兔、雪兔、海南兔等7種曠兔屬物種與福建黃兔(穴兔屬)聚為一支，支持將福建黃兔劃歸為穴兔屬。

圖2 福建黃兔線粒體基因組控制區(qū)結(jié)構(gòu)Fig.2 Control region structure of mitochondrial genome in Fujian Yellow Rabbit

圖3 基于線粒體基因組D-loop區(qū)采用鄰接(NJ)法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 NJ phylogenetic trees based on mitochondrial genome D-loop region

3 討論與結(jié)論

脊椎動物線粒體基因組長度基本穩(wěn)定在 16～17.5 kb，少數(shù)物種序列長度差異較大，如短刀側(cè)殖文昌魚線粒體基因組長度為14 991 bp，馬達(dá)加斯加彩蛙和大西洋盲鰻線粒體基因組長度分別為22 874 bp和18 909 bp。蛋白編碼基因序列總長穩(wěn)定在11.3 kb左右，tRNA基因和rRNA基因總長分別在1.5 kb、2.5 kb左右，物種間3 種基因的序列組成也較為接近[13]。本研究發(fā)現(xiàn)福建黃兔線粒體基因組序列全長17 000 bp，蛋白編碼基因、rRNA、tRNA的長度及基因排列順序與其他脊椎動物基本一致，基因排列緊密，間隔和重疊序列較少。基因組全序列具有明顯的AT偏好性，A+T含量高于G+C含量的特點與已公布的其他兔形目動物相同[14-15]。福建黃兔13個蛋白編碼基因起始密碼子以ATG(10個)為主，終止密碼子以TAA(8個)、TAG(3個)居多，終止密碼子存在6個不完全終止密碼子(T、TA或AG)，通過轉(zhuǎn)錄后的多聚腺嘌呤機制補足為TAA或AGA終止密碼子[16]。對密碼子使用頻率分析可知，福建黃兔編碼基因中共有34個RSCU值大于1的偏好密碼子，密碼子第3位堿基中A、C占比明顯高于G、T，這與密碼子具有使用偏倚性相一致。此外，密碼子第2位堿基多為嘧啶，這些特性決定編碼基因多編碼疏水氨基酸，由于線粒體編碼蛋白主要是與內(nèi)膜結(jié)合的呼吸鏈成分，因此疏水氨基酸的偏好性是與其功能相適應(yīng)的[17-18]。

rRNA基因在蛋白合成過程中的二級結(jié)構(gòu)決定其功能[19]，莖區(qū)、環(huán)區(qū)結(jié)構(gòu)中含有的重要親緣信息，常用于系統(tǒng)發(fā)生的研究[20]。將福建黃兔rRNA序列結(jié)構(gòu)與其他脊椎動物比對分析后發(fā)現(xiàn)，其rRNA結(jié)構(gòu)相對保守，12sRNA與16sRNA相比更加保守，這一結(jié)果符合rRNA的進(jìn)化規(guī)律。本研究中福建黃兔tRNA-Ser(AGY)因缺失DHU臂不能折疊成經(jīng)典的三葉草結(jié)構(gòu)，這在脊椎動物中比較常見。對DHU臂缺失現(xiàn)象的研究表明，tRNA在缺失DHU臂的情況下仍然可以形成潛在的L型結(jié)構(gòu)來保證tRNA接受臂與反密碼子之間的距離，從而維持其攜帶、轉(zhuǎn)運特定氨基酸的功能[21-22]。

與其他哺乳動物mtDNA一樣，L鏈復(fù)制起始區(qū)位于5個tRNA形成的基因簇中，在tRNA-Asn和tRNA-Cys之間，序列同源性較高，該區(qū)域可能形成穩(wěn)固的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。在福建黃兔中，利用RNAfold軟件計算最小自由能表明L鏈復(fù)制起始區(qū)的二級結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定。D-loop區(qū)是線粒體基因編碼的控制區(qū)，負(fù)責(zé)mtDNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，也是復(fù)制過程中mtDNA與線粒體內(nèi)膜的結(jié)合位點。福建黃兔線粒體D-loop區(qū)在tRNA-Glu基因和tRNA-Phe基因之間，同絕大多數(shù)脊椎動物一樣含有3個結(jié)構(gòu)域，其中中央保守區(qū)較為保守，延長終止序列和保守序列區(qū)在堿基組成與長度上均表現(xiàn)出異質(zhì)性[23]。D-loop區(qū)中短串聯(lián)重復(fù)序列的拷貝數(shù)相對穩(wěn)定，長串聯(lián)重復(fù)序列因終止子缺乏容易發(fā)生拷貝數(shù)的變化[24]。D-loop區(qū)的重復(fù)序列拷貝數(shù)改變、序列插入和缺失等都是物種進(jìn)化的表征[25]。將福建黃兔D-loop區(qū)序列與穴兔比對發(fā)現(xiàn)，福建黃兔缺少兩個153 bp的長串聯(lián)重復(fù)，這表明其屬于進(jìn)化的物種。

D-loop區(qū)富含A、T堿基，其堿基替換率較mtDNA其他部分高5～10倍[26]，是線粒體基因組的高變區(qū)。D-loop區(qū)具有進(jìn)化壓力較小、遺傳變異大、進(jìn)化速度快的特點，被廣泛用于物種間或物種內(nèi)的進(jìn)化分析[27]。本研究將測序所得的福建黃兔D-loop區(qū)序列與已公布的多個物種D-loop區(qū)序列進(jìn)行多重比對后構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果支持將福建黃兔的祖先歸為穴兔。

本研究測定并分析福建黃兔線粒體基因組全序列，結(jié)果表明，福建黃兔線粒體基因組的組成、結(jié)構(gòu)與其他脊椎動物相似，基因組全長17 000 bp，無內(nèi)含子，基因排列順序基本一致。對D-loop區(qū)的分析發(fā)現(xiàn)，福建黃兔線粒體也可以檢測到3 個保守序列模塊(CSB1, CSB2和CSB3)、2個終止序列(ETAS1和ETAS2)、重復(fù)序列RS3和RS2，不同的是RS2序列與穴兔相比缺少2個拷貝的LR重復(fù)片段。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近為研究福建黃兔的起源進(jìn)化和特定遺傳特性的形成機制奠定基礎(chǔ)。