35個白榆優(yōu)良家系種子萌發(fā)期耐鹽堿性評價

朱建峰，張會龍，楊秀艷，武海雯，張華新

(1.國家林業(yè)和草原局鹽堿地研究中心，北京 100091；2.中國林業(yè)科學研究院天津林業(yè)科學研究所，天津 300457)

白榆(Ulmuspumila)為高大喬木，耐鹽堿性突出，自然分布恰好覆蓋中國北方鹽堿地分布區(qū)，生態(tài)防護功能和經濟利用價值高，是中國北方少有的廣域性分布耐鹽堿喬木樹種[1-3]。近年研究發(fā)現，中國鹽堿地區(qū)多有成片或零星白榆資源分布，每年大量種子散落，但林下極少有幼苗成活，表明鹽堿地白榆天然更新出現障礙[4]。天然更新是森林更新的重要方式，必須滿足3個條件：充足且有生命力的種子；適合種子萌發(fā)成苗的條件；適合幼樹生長的環(huán)境條件，其中任一環(huán)節(jié)出現問題，更新就會出現障礙[5]。白榆7a生大樹平均株產1.7kg種子[6]，約有20多萬粒，發(fā)芽率一般為65%～85%[7]，表明白榆可產生充足且有生命力的種子。白榆1a生苗可耐土壤鹽含量為0.6%的脅迫強度[8]，表明白榆幼苗可在一定濃度鹽脅迫下成活和生長。白榆種子在土壤含鹽量0.2%或0.2%以上，萌發(fā)出苗率急劇下降，當土壤鹽含量為0.4%時，出苗成活率僅為5%左右[4]，說明鹽堿脅迫極大降低了白榆萌發(fā)成活率。由此可見，鹽堿脅迫下種子萌發(fā)是鹽堿地白榆天然更新的首要障礙因子。

種子萌發(fā)是植物生活史的關鍵階段，也是植物抗逆性最弱的時期，決定著植物種群的繁衍、進化和農林業(yè)生產，具有重要的生物學和生產實踐意義[9]。當前，白榆耐鹽研究主要集中在成苗后生長時期，結果表明白榆具很強耐鹽性及相應的耐鹽機制[8,10-11]，但萌發(fā)期耐鹽堿性弱[4]，嚴重限制了白榆種群繁衍和生態(tài)防護功能發(fā)揮。白榆分布廣變異大，初步研究結果表明不同家系間耐鹽性具有較大遺傳差異[12]，但成規(guī)模的白榆品系間萌發(fā)期耐鹽堿性評價研究尚未見報道。

自2008年，國家林業(yè)和草原局鹽堿地研究中心系統(tǒng)收集了中國70年代以來選育的白榆良種資源，在天津濱海新區(qū)營建了白榆優(yōu)良種質資源基因庫[3]。本試驗以來自白榆優(yōu)良種質資源基因庫(天津濱海新區(qū))的35個白榆家系種子為試驗材料，分別采用150mmol/L NaCl和50mmol/L NaHCO3對白榆種子萌發(fā)進行鹽堿脅迫，觀測分析發(fā)芽率、發(fā)芽指數、發(fā)芽勢、根長、芽長和鮮質量6個萌發(fā)指標，研究不同白榆家系間耐鹽堿性分化程度，鑒定萌發(fā)期耐鹽性評價指標，應用隸屬函數法對不同白榆家系進行耐鹽堿性綜合評價。進一步研究不同鹽堿濃度對3個不同耐鹽堿性白榆家系萌發(fā)的影響，并計算耐鹽堿閾值，從而對隸屬函數法評價白榆萌發(fā)期耐鹽堿性所得結果進行驗證。本研究結果可為萌發(fā)期高耐鹽堿性白榆品系選育及在鹽堿地區(qū)的推廣應用提供理論依據和良種材料，篩選出的耐鹽和鹽敏感家系，也可為林木(白榆)種子萌發(fā)期耐鹽堿機制研究提供理想試驗材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為35個白榆優(yōu)良家系種子，材料編號、名稱和千粒質量詳見表1，全部來自國家林業(yè)和草原局鹽堿地研究中心白榆優(yōu)良種質資源基因庫(天津濱海新區(qū))。

表1 參試材料Table 1 Experimental materials

1.2 試驗方法

分別挑選各白榆家系飽滿無病蟲害、大小均一的種子，先用蒸餾水沖洗干凈，再用吸水紙吸干種子表面水分備用。根據預試驗結果，以150 mmol/L NaCl和50 mmol/L NaHCO3處理白榆種子，以蒸餾水為對照。每個家系取20粒種子均勻置于直徑9 cm，鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿內，每個處理設置3個重復。水平放置于溫度為25 ℃的人工培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，試驗時間為7 d(預試驗結果表明不同家系種子在對照及鹽堿脅迫處理下最遲發(fā)芽時間為4 d)。試驗開始時記錄每個培養(yǎng)皿質量，試驗過程中用稱重法補充蒸發(fā)的水量，即每天定時用天平稱量后補充蒸發(fā)水分，使鹽濃度保持不變。驗證試驗中NaCl處理濃度為50 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L和300 mmol/L，NaHCO3處理濃度為25 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L和200 mmol/L，以蒸餾水為對照(CK)，其他試驗條件同上。

1.3 測定項目及方法

參考牟雪姣等[13]的試驗方法，每天統(tǒng)計發(fā)芽數，以胚根明顯突破種皮為發(fā)芽標準，第7天測量根長、芽長和鮮質量，試驗結束后計算發(fā)芽率、發(fā)芽指數和發(fā)芽勢。

發(fā)芽率=發(fā)芽種子數/種子總數×100%

發(fā)芽指數=∑(Gt/Dt)(式中：Gt為第t天的發(fā)芽總數，Dt為相應的天數)

發(fā)芽勢=日最高峰時種子發(fā)芽數/種子總數×100%

根長和芽長：脅迫7 d后，每個重復隨機選取3株，在實驗臺上用直尺測量每一個發(fā)芽種子的根長和芽長，以3個重復的平均值作為根長和芽長。

鮮質量：脅迫7 d后，每個重復隨機選取3株稱量(包含根和芽)，以3個重復的平均值作為鮮質量。

1.4 數據統(tǒng)計與處理分析

2 結果與分析

2.1 鹽堿脅迫對白榆種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數和發(fā)芽勢的影響

發(fā)芽率是指在規(guī)定時間內萌發(fā)種子數占供試種子總數的百分率，代表種子的萌發(fā)能力。由表2可知，與對照相比35個白榆家系發(fā)芽率未發(fā)生顯著變化，說明在時間充足的條件下，一定濃度的鹽堿脅迫對白榆萌發(fā)抑制不顯著。

發(fā)芽指數反映種子萌發(fā)期的綜合活力，指數越大萌發(fā)速度越快、活力越高。鹽脅迫34個家系種子發(fā)芽指數顯著低于對照，只有家系097與對照相比未發(fā)生顯著變化。堿脅迫條件下21個家系種子發(fā)芽指數顯著低于對照，與對照相比14個家系未發(fā)生顯著變化。結果表明，鹽堿脅迫可顯著推遲大多數白榆家系的萌發(fā)時間。

發(fā)芽勢反映的是種子萌發(fā)的整齊度，數值越大萌發(fā)整齊度越高。鹽脅迫下22個家系與對照相比未發(fā)生顯著變化，12個家系發(fā)芽勢顯著低于對照，1個家系發(fā)芽勢顯著高于對照。堿脅迫下16個家系與對照相比未發(fā)生顯著變化，18個家系發(fā)芽勢顯著低于對照，1個家系發(fā)芽勢顯著高于對照。結果表明，鹽堿脅迫可顯著降低部分白榆家系萌發(fā)整齊度，其中堿脅迫的抑制更為顯著。

2.2 鹽堿脅迫對白榆種子根長、芽長和鮮質量的影響

種子的根長、芽長和鮮質量可表示萌發(fā)期生長速率[15]，是萌發(fā)種子能否成活的關鍵指標。由表3可知，鹽堿脅迫下30個家系種子根長顯著低于對照，5個家系未發(fā)生顯著變化。鹽堿脅迫下35個家系種子芽長均顯著低于對照。鹽脅迫下35個家系種子鮮質量均顯著低于對照；堿脅迫下25個家系種子鮮質量顯著低于對照，10個家系未發(fā)生顯著變化。結果表明，鹽堿脅迫顯著抑制大多數白榆家系萌發(fā)期生長速率，進而可大幅度降低萌發(fā)成活率。萌發(fā)期能忍耐鹽堿脅迫快速生長的白榆家系，具有更強的耐鹽堿性，往往能在鹽堿條件下成活。因此，根長、芽長和鮮質量3個生長指標更適宜作為白榆萌發(fā)期耐鹽堿性評價指標。

2.3 鹽堿脅迫下白榆萌發(fā)指標隸屬函數值及綜合評價

隸屬函數值能綜合多個指標反映不同家系間受鹽堿脅迫影響的程度，避免某幾個或單一指標評價的片面性[16-17]，值越大代表鹽堿脅迫的影響越小，耐鹽堿性越強。由表2和表3可知，鹽堿脅迫下白榆種子發(fā)芽率與對照相比未發(fā)生顯著變化，而發(fā)芽指數、發(fā)芽勢、根長、芽長和鮮質量多表現為顯著降低。因此，選取發(fā)芽指數、發(fā)芽勢、根長、芽長和鮮質量5個指標計算隸屬函數值，對白榆萌發(fā)期耐鹽堿性進行評價。耐鹽堿等級評定參照張亞娟等[14]的定級標準。由表4可知，高耐鹽、中耐鹽、低耐鹽、不耐鹽家系分別為2個、8個、13個和12個，占家系總數的5.71%、 22.86%、 37.14%和34.28%。高耐堿、中耐堿、低耐堿、不耐堿家系分別為3個、9個、16個和7個，占家系總數的8.57%、25.71%、45.71%和 20.00%。結果表明，大多數白榆家系萌發(fā)期耐鹽堿性差，甚至對鹽堿脅迫敏感。

表2 鹽堿脅迫下白榆種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數和發(fā)芽勢的變化情況Table 2 Variation of germination rate, germination index and germination energy of Ulmus pumila seeds under saline-alkali stress

表3 鹽堿脅迫下白榆種子根長、芽長和鮮質量的變化情況Table 3 Variation of root length, shoot length and fresh mass of Ulmus pumila seeds under saline-alkali stress

表4 鹽堿脅迫下白榆萌發(fā)指標隸屬函數值Table 4 Subordinate function values of germination indexes of Ulmus pumila under saline-alkali stress

2.4 鹽堿脅迫下白榆種子萌發(fā)指標隸屬函數值與平均隸屬函數值相關性分析

為分析白榆種子萌發(fā)指標隸屬函數值與平均隸屬函數值間的關系，對萌發(fā)指標隸屬函數值與平均隸屬函數值進行相關性分析[18]。由表5可知，鹽脅迫下5個指標與平均隸屬函數均呈極顯著正相關，說明其能較好的表征白榆萌發(fā)期耐鹽程度，可用于綜合評價白榆種子萌發(fā)期的耐鹽性。堿脅迫下除發(fā)芽指數外，其余4個指標與平均隸屬函數均呈極顯著正相關，說明這4個指標能較好的表征白榆萌發(fā)期耐堿程度，可用于綜合評價白榆種子萌發(fā)期的耐堿性。鹽堿脅迫條件下，根長和芽長2個指標與平均隸屬函數值的相關性均為最高，表明這2個指標最能表征白榆萌發(fā)期耐鹽堿程度。

表5 鹽堿脅迫下白榆種子萌發(fā)指標隸屬函數值與平均隸屬函數值的相關性分析Table 5 Correlation analysis between subordinate function value and the average subordinate function value of germination index of Ulmus pumila under saline-alkali stress

2.5 不同鹽堿濃度脅迫對不同耐鹽堿性白榆家系萌發(fā)指標的影響

為進一步研究鹽堿脅迫對白榆萌發(fā)的影響，測定了不同鹽堿濃度脅迫下中高耐鹽堿家系087、低耐鹽堿家系064和不耐鹽堿家系0132的萌發(fā)期指標。由圖1可知，除高鹽(NaCl 300 mmol/L)堿(NaHCO3100 mmol/L和200 mmol/L)濃度外，白榆種子萌發(fā)對鹽堿脅迫并不敏感，且與家系087相比家系064和0132發(fā)芽率隨鹽堿濃度升高降低幅度反而更小。隨NaCl濃度升高，家系087發(fā)芽指數表現出先升高后降低的趨勢，家系064和0132發(fā)芽指數呈逐漸降低的趨勢；隨著NaHCO3濃度升高，家系087、064和0132發(fā)芽指數均呈降低趨勢。隨NaCl濃度升高，家系087發(fā)芽勢表現出先升高后降低的趨勢，家系064和0132呈逐漸降低的趨勢；隨NaHCO3濃度升高，家系087發(fā)芽勢未發(fā)生顯著變化，家系064和0132發(fā)芽勢呈降低趨勢。家系087根長隨NaCl濃度升高表現出先升高后降低的趨勢，隨NaHCO3濃度的升高未發(fā)生顯著性降低；家系064和0132隨NaCl 和NaHCO3濃度升高呈逐漸降低的趨勢。家系087芽長隨NaCl濃度升高表現出先升高后降低的趨勢，隨NaHCO3濃度的升高呈逐漸降低的趨勢；家系064和0132隨NaCl 和NaHCO3濃度升高呈逐漸降低的趨勢。隨NaCl濃度升高，家系087和064鮮質量表現出先升高后降低的趨勢，家系0132鮮質量均呈逐漸降低的趨勢；隨NaHCO3濃度的升高，家系087鮮質量未發(fā)生顯著性降低，家系064和0132鮮質量均呈逐漸降低的趨勢。可見，鹽堿脅迫下3個白榆家系發(fā)芽率與對照相比大多未發(fā)生顯著變化，但發(fā)芽指數、發(fā)芽勢、根長、芽長和鮮質量多表現為顯著性降低或升高，其中根長、芽長和鮮質量最為顯著。因此發(fā)芽指數、發(fā)芽勢、根長、芽長和鮮質量適宜作為衡量白榆種子萌發(fā)期耐鹽堿性指標，與表2、表3、表5的研究結果也較為一致。

不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著

2.6 白榆不同耐鹽堿性家系萌發(fā)期耐鹽堿閾值

為進一步驗證隸屬函數法評價白榆萌發(fā)期耐鹽堿性的準確性，以相對長度生長量(根長和芽長之和)降為對照50%時所對應的鹽堿濃度(C50)為耐鹽堿閾值[19]。以NaCl和NaHCO3濃度為自變量(x)，以不同鹽堿濃度脅迫下3個不同耐鹽堿性白榆家系萌發(fā)期相對生長量作為因變量(y)建立回歸方程(表 6)，發(fā)現白榆3個家系的耐鹽和耐堿性強弱順序均為：家系087>家系064>家系0132，耐鹽閾值為76.28～161.60 mmol/L，耐堿閾值為31.20～66.17 mmol/L。3個家系的耐鹽堿性排序與通過隸屬函數法所得耐鹽堿性排序一致(表4)。結果表明，選取發(fā)芽指數、發(fā)芽勢、根長、芽長和鮮質量5個指標，應用隸屬函數法評價白榆萌發(fā)期耐鹽堿性可靠性高，且不同白榆家系間耐鹽堿性遺傳差異大。

3 討 論

種子萌發(fā)是植物成功建植的第一步，是種胚從生命活動相對靜止恢復到生理活躍狀態(tài)的生長發(fā)育過程，也是植物生活周期中抗逆性最弱的階段[9,20]，耐鹽堿性最弱的時期。例如，狼尾草苗期半致死鹽濃度是其種子萌發(fā)期的2.7倍[21]；高鹽度可抑制大多數鹽生植物種子萌發(fā)，直至有淡水補充脅迫減輕時才能萌發(fā)[22]。白榆種子在土壤含鹽量0.2%及以上時萌發(fā)出苗率便急劇下降[4]，但1 a生白榆家系苗多可耐土壤鹽堿含量為0.6%的脅迫強度[8]，說明萌發(fā)期也是白榆耐鹽堿性最弱的階段，但成苗后其耐鹽堿性普遍增強。隸屬函數法可綜合多個指標反映植物抗逆性，避免某幾個或單一指標評價的片面性[16-17]。例如，利用隸屬函數法綜合多指標對10個不同甘藍型油菜品種萌發(fā)期抗旱性進行排序[23]，對14個紫花苜蓿品種萌發(fā)期抗旱耐鹽性進行綜合分析[24]。在白榆耐鹽性研究中，利用隸屬函數法對12個白榆無性系耐鹽性進行評價，篩選出3個耐鹽性強的無性系[25]；對3個1 a生白榆品系進行耐鹽性評價，篩選出綜合耐鹽性較高的白榆品系Y65[26]。但當前應用隸屬函數法研究不同白榆家系萌發(fā)期耐鹽堿性的工作尚未見報道。因此，應用隸屬函數法對白榆家系萌發(fā)期耐鹽堿性進行綜合評價，篩選萌發(fā)期高耐鹽堿性白榆種質即可行又具有重要的現實意義，可為解決鹽堿地白榆天然更新受阻難題，實現鹽堿地低成本規(guī)模化的生物修復提供優(yōu)良新品種。

表6 不同白榆家系萌發(fā)期臨界NaCl和NaHCO3濃度Table 6 Critical NaCl and NaHCO3 concentrations in different Ulmus pumila family at germination stage

種子從萌發(fā)到成苗(發(fā)芽種子長出真葉)一般以自養(yǎng)為主，主要靠儲藏物質水解供給生長，期間一般只需從外界吸收水分和氧氣[9,27]。因此，本試驗采用蒸餾水處理為對照，與其他研究植物萌發(fā)期抗逆性的試驗方法相一致。例如，以蒸餾水處理為對照，研究干旱和鹽堿脅迫對堿蓬和鹽地堿蓬種子萌發(fā)的影響[28]、干旱脅迫對酸棗種子萌發(fā)的影響[29]。種子大小決定著儲藏物質的多少，可能影響鹽脅迫下種子萌發(fā)和生長。但本研究中發(fā)現鹽堿脅迫下各白榆家系種子千粒質量隸屬函數值與相對根長、芽長、鮮質量和平均隸屬函數值之間并無顯著相關性，說明白榆種子大小與萌發(fā)期耐鹽堿性并不相關，這與在架豆角種子中的研究結論相似[30]。隨NaCl濃度升高，家系087根長、芽長和鮮質量表現出先升高后降低的趨勢，而家系0132根長、芽長和鮮質量均呈逐漸降低的趨勢，說明中高耐鹽堿白榆家系可能是通過提高生長速率，尤其是根系生長速度，加速吸水，降低體內鹽濃度；同時高生長速率可使種子快速渡過萌發(fā)期，成苗后隨著植株的生長耐鹽堿性逐漸增強，從而抵御外界鹽堿脅迫提高萌發(fā)成活率。這與鹽脅迫對紅心蘿卜種子[31]、燕麥種子[32]萌發(fā)和生長影響的研究結果基本一致。

鹽堿脅迫下白榆發(fā)芽率與對照相比未發(fā)生顯著性變化，但發(fā)芽指數、發(fā)芽勢、根長、芽長和鮮質量多表現為顯著性降低或升高，其中根長、芽長和鮮質量最為顯著。驗證試驗中也發(fā)現，白榆萌發(fā)對鹽堿脅迫多不敏感，但較高鹽堿濃度下萌發(fā)的種子胚根和胚芽生長緩慢，多不能成活，表明發(fā)芽率不適宜表征白榆萌發(fā)期耐鹽堿性。鹽生植物紅砂萌發(fā)期耐鹽性研究發(fā)現，隨著鹽濃度升高發(fā)芽率顯著降低，但萌發(fā)的種子多能成活[33]，表明發(fā)芽率可表征紅砂萌發(fā)期耐鹽堿性。根據現有研究結果，推測非鹽生植物萌發(fā)對鹽堿脅迫不敏感，水分溫度等條件適宜時，種子便開始萌發(fā)，但萌發(fā)后生長對外界鹽堿脅迫敏感，當鹽堿脅迫較高時多生長緩慢不能成活。鹽生植物萌發(fā)可感知外界鹽堿脅迫，當鹽堿脅迫濃度低或可以忍受時開始萌發(fā)，萌發(fā)后可忍耐外界的鹽堿脅迫濃度，生長迅速最終成活；外界鹽堿脅迫濃度過高時，種子停止萌發(fā)，待條件適宜時再萌發(fā)，可能是鹽生植物逆境條件下的一種“保活”機制。例如，鹽堿濃度越大鹽生植物灰綠藜種子復水后萌發(fā)恢復率越高[34]。因此，不同類型植物萌發(fā)期耐鹽堿性評價，適宜的指標往往也不相同，推測非鹽生植物適宜選取根長、芽長等生長指標，鹽生植物適宜選取發(fā)芽率、發(fā)芽指數等萌發(fā)指標。

本試驗篩選出的中高耐鹽家系10個，中高耐堿家系12個，其中8個家系0102、037、07、080、087、094、54和82003同屬中高耐鹽和耐堿家系，占中高耐鹽家系的80%，中高耐堿家系的67%。不耐鹽家系12個，不耐堿家系7個，其中3個家系0120、047和0132同屬不耐鹽和不耐堿家系，占不耐鹽家系的25%，不耐堿家系的43%。結果表明白榆萌發(fā)期耐鹽和耐堿具有一定的相關性，往往耐鹽家系也耐堿，近期在玉米中的研究也發(fā)現其對鹽和堿的耐性高度相關[35]；而不耐鹽和不耐堿家系相關性較差。

白榆是一個生境大分布廣而復雜的樹種，內部遺傳變異大[3]，筆者前期及本研究結果均表明白榆不同家系間萌發(fā)期耐鹽性遺傳差異較大[12]，李慶賤等[8]對9個白榆家系1 a生苗耐鹽性進行了研究，發(fā)現成苗后白榆家系間耐鹽性遺傳差異也較大，但白榆萌發(fā)期與成苗后耐鹽性之間有無關聯的研究尚未見報道。田又升等[36]將水稻萌發(fā)期抗旱性鑒定結果與大田產量的抗旱系數進行相關性分析，結果顯示不存在顯著相關性，說明萌發(fā)期抗旱性不能代表水稻成苗后的抗旱水平；而張金霞等[37]對3個大豆品種萌發(fā)期和苗期的耐鹽性進行了研究，發(fā)現冀豆12萌發(fā)及苗期耐鹽性均高于另外2 個品種，說明對大豆來說，萌發(fā)期的耐鹽性也可能代表了成苗后的耐鹽性，這可能與植物種類和脅迫類型不同有關。因此，白榆萌發(fā)期與成苗后耐鹽性之間是否相關？這將是今后白榆耐鹽性研究的一個重要方面。

4 結 論

本研究通過對35個白榆家系萌發(fā)期耐鹽堿指標的綜合評價，發(fā)現發(fā)芽指數、發(fā)芽勢、根長、芽長和鮮質量適宜表征白榆萌發(fā)期耐鹽性，發(fā)芽勢、根長、芽長和鮮質量適宜表征白榆萌發(fā)期耐堿性，其中根長和芽長是表征耐鹽和耐堿性效果最好的指標。白榆萌發(fā)期高耐鹽2個家系087和094，不耐鹽12個家系0120、0132、0133、047、75027、7807、8504、古20、陵3、天優(yōu)、鉆天和029；高耐堿3個家系080、82003和0102，不耐堿7個家系001、0120、013、0132、043、047和61。綜合比較發(fā)現白榆萌發(fā)期中高耐鹽堿8個家系0102、037、07、080、087、094、54和82003，不耐鹽堿3個家系0120、0132和047。

35個白榆家系中篩選出萌發(fā)期高耐鹽家系2個，不耐鹽家系12個，平均隸屬函數值為0.14～0.86；高耐堿家系3個，不耐堿家系7個，平均隸屬函數值為0.14～0.81。驗證試驗中發(fā)現萌發(fā)期中高耐鹽堿家系087，耐鹽堿閾值分別為 161.60和66.17 mmol/L；不耐鹽堿家系0132，耐鹽堿閾值分別為76.28和31.20 mmol/L。可見，白榆家系間萌發(fā)期耐鹽堿性遺傳差異大，具有耐鹽堿良種選育潛力，也說明隸屬函數法評價白榆家系間萌發(fā)期耐鹽堿性可靠性高。