AhR基因缺陷抑制小鼠脾臟樹突細胞TLR7/9介導的細胞因子分泌

劉茂林, RIPPLEY Berry，LEE Soyoeng

(1.杭州師范大學 醫學院，浙江 杭州 311121；2.日本國立大阪大學免疫學前沿研究中心, 日本 大阪 565-0871)

樹突狀細胞(dendritic cells, DCs)是目前發現的體內功能最強的抗原提呈細胞(antigen presenting cells, APCs)，在激發和控制獲得性免疫反應的程度和范圍中起關鍵作用。DCs通過分泌細胞因子和趨化因子調節炎癥反應，與自身免疫性疾病(autoimmune disease，AID)的發生發展密切相關，在系統性紅斑狼瘡(SLE)、類風濕性關節炎(RA)、白塞病(BD)、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、銀屑病、哮喘等多種AID中起重要調控作用。研究[1]表明，DCs已成為免疫治療的靶點細胞。芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor，AhR)是一種配體依賴性的轉錄因子，AhR在T細胞、單核細胞和DCs的功能調節方面均扮演重要角色，一些炎癥相關細胞因子的產生與AhR信號通路也存在著一定關系[2]。本研究通過觀察AhR 基因缺陷小鼠對Toll樣受體7/9(toll-like receptors 7/9，TLR7/9)介導的脾臟DCs分泌的AID相關細胞因子變化，探討AhR對DCs免疫調節作用的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 選用C57BL/6J小鼠12只，雄性，8周齡，體質量(20±2) g，野生(wild type,WT)鼠購自日本CLEA股份有限公司，AhR基因敲除(AhR-/-)鼠由Yoshiaki Fujii-Kuriyama提供 (日本筑波大學)。動物實驗經日本國立大阪大學生物科學院動物保護和使用倫理委員會批準。

1.2 主要試劑和儀器 RPMI 1640 培養基購自Sigma公司，小鼠DCs分離盒、CD11c Micro Beads、免疫磁珠分選儀、分選柱購自德國Miltenyi Biotec公司，RNA RNeasy 購自Qiagen公司，小鼠白介素-6 (IL-6)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、引物購自Applied Biosystems公司，TLR9激動劑CpG-A、CpG-B購自Gene Design公司，TLR7激動劑咪喹莫特(Imiquimod)購自3M Health Care公司，小鼠IL-6、TNF-α ELISA檢測試劑盒購自Biolegend公司，ABI PRISM 7900 HT熒光定量PCR儀購自Applied Biosystems公司。

1.3 小鼠脾臟單個核細胞的制備 小鼠斷頸處死，無菌取脾臟，PBS沖洗2次后，去除脾臟表面被膜。于220目金屬濾網上，無菌注射器活塞反復研磨脾臟釋放細胞，采用70 μm細胞過濾器過濾細胞液，收集細胞并加入PBS稀釋至14 mL。

1.4 小鼠脾臟CD11c+樹突狀細胞的提取 采用免疫磁珠細胞分選(MACS)法收集小鼠脾臟CD11c+樹突狀細胞，按照試劑盒說明書步驟進行。每1×108細胞懸液中加入0.25 μg小鼠Fc受體阻滯劑(CD16/CD32)單克隆抗體、100 μL CD11c微珠。通過MACS分選柱收集磁性標記細胞，所得脾臟CD11c+樹突細胞用10 mL RPMI 1640培養基(5×105cells/mL)重懸后備用。

1.5 脾臟CD11c+樹突細胞實驗分組 每孔100 μL 2.5×105cells小鼠脾臟CD11c+樹突細胞于5%CO2細胞培養箱，37℃孵育2 h。WT鼠CD11c+樹突細胞實驗分組：①Control組(100 μL 2.5×105cells CD11c+樹突細胞，PBS 200 μL),②CpG-A組(100 μL 2.5×105cells CD11c+樹突細胞，1 μmol/L CpG-A 100 μL)，③CpG-B組(100 μL 2.5×105cells CD11c+樹突細胞，1 μmol/L CpG-B 100μL)，④Imiquimod組(100 μL 2.5×105cells CD11c+樹突細胞，500 μg/mL Imiquimod 20μL)。AhR-/-鼠CD11c+樹突細胞實驗分組：①Control組(100 μL 2.5×105cells CD11c+樹突細胞，PBS 200 μL),②CpG-A組(100 μL 2.5×105cells CD11c+樹突細胞，1 μmol/L CpG-A 100 μL)，③CpG-B組(100 μL 2.5×105cells CD11c+樹突細胞，1 μmol/L CpG-B 100μL)，④Imiquimod組(100 μL 2.5×105cells CD11c+樹突細胞，500 μg/mL Imiquimod 20μL)。各組用PBS調整至300 μL，共同培養24 h。

1.6 酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測細胞因子水平 采用ELISA試劑盒分別檢測各組細胞上清液中IL-6、TNF-α水平，各組均設3個復孔，實驗重復3次。

1.7 實時定量PCR檢測 采用RNeasy試劑盒提取小鼠脾臟CD11c+樹突狀細胞的總RNA并進行反轉錄，所有操作按照試劑盒說明書進行。使用小鼠IL-6引物：5′- TGTGCAATGGCAATTCTGAT-3′, 5′-GGTACTCCAGAAGACCAGAGGA-3′；TNF-α引物: 5′-TGCCTATGTCTCAGCCTCTTC-3′,5′-GGTCTGGGC CATAGAACTGA-3′。以GAPDH為內參對照，定量PCR過程：50°C 2 min，95°C 10 min, 95°C循環40次15 s，60°C 1 min。IL-6、TNF-α mRNA相對表達量采用ΔΔCt法，實驗重復3次。

1.8 統計學方法 采用SPSS18.0統計學軟件，計量資料比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AhR基因敲除對小鼠脾臟樹突細胞表達IL-6的影響 WT鼠和AhR-/-鼠的CpG-A組、CpG-B組、Imiquimod組的脾臟樹突細胞IL-6 mRNA和IL-6表達量均高于各對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)；AhR-/-鼠的CpG-A組、CpG-B組、Imiquimod組脾臟樹突細胞IL-6 mRNA和IL-6表達量均分別低于WT鼠的CpG-A組、CpG-B組、Imiquimod組，差異均有統計學意義(P<0.05)；見圖1、圖2。

注：與組內Control比較，***P<0.001；與同處理WT組比較，# P<0.05， ### P<0.001。圖1 AhR基因敲除對小鼠脾臟樹突細胞IL-6 mRNA表達的影響

注：與組內Control比較，***P<0.001；與同處理WT組比較，# P<0.05，## P<0.01， ### P<0.001。圖2 AhR基因敲除對小鼠脾臟樹突細胞IL-6表達的影響

2.2 AhR基因敲除對小鼠脾臟樹突細胞表達TNF-α的影響 WT鼠和AhR-/-鼠的CpG-A組、CpG-B組和 Imiquimod組的脾臟樹突細胞TNF-α mRNA和TNF-α表達量均高于各對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)；AhR-/-鼠的CpG-A組、CpG-B組、Imiquimod組脾臟樹突細胞TNF-α mRNA和TNF-α表達量均分別低于WT鼠的CpG-A組、CpG-B組、Imiquimod組，差異均有統計學意義(P<0.05)；見圖3、圖4。

注：與組內Control比較，**P<0.01,***P<0.001；與同處理WT組比較，# P<0.05，## P<0.01， ### P<0.001。圖3 AhR基因敲除對小鼠脾臟樹突細胞TNF-α mRNA表達的影響

注：與組內Control比較，**P<0.01,***P<0.001；與同處理WT組比較，# P<0.05，## P<0.01， ### P<0.001。圖4 AhR基因敲除對小鼠脾臟樹突細胞TNF-α表達的影響

3 討論

樹突狀細胞(DCs)在免疫系統中具有獨特地位，在免疫識別、免疫應答和免疫調控中發揮重要作用，決定著免疫應答的結果及強度，并在疾病的免疫治療中有著深遠的應用前景[1]。在DCs各亞型中，CD11c+樹突狀細胞有刺激T細胞增殖及分泌更多的IL-6、 IL-10、TNF-α、IFN-α等炎性因子的作用，與AID發生發展密切相關[3]。DCs表面的I型跨膜蛋白-Toll樣受體(TLRs)是連接天然免疫和獲得性免疫的關鍵分子，為細胞表面重要的模式識別受體。在機體獲得性免疫中，TLRs家族成員中的TLR7、TLR8和TLR9高度同源，在細胞內涵體中起作用，吞噬和包膜溶解后結合其配體，可識別微生物的核酸。TLR7可識別咪喹啉家族低分子量的Imiquimod等，TLR9可識別細菌的CpG-DNA，激活APC 樹突狀細胞的免疫刺激特性，在樹突狀細胞成熟過程中起重要的調控作用[4]。

TLRs的激活及其介導的信號轉導機制一直是研究的重點。在特定條件下, TLRs可在細胞表面異常高表達和過度激活。除外源性配體外，TLRs還可識別一些內源性分子，甚至識別自身組織成分,引發機體功能紊亂,導致AID發生。研究[5-6]表明，TLRs參與許多慢性炎癥和AID的發生、發展。因此，TLRs 的激活必須受到嚴格的負調控，以保持免疫系統的穩定。隨著對TLRs 信號通路認識的逐步深入，基于TLRs 及其信號通路為靶點的干預治療成為研究的熱點，為AID的治療提供理論基礎及新的藥物靶點[7]。

細胞因子參與免疫細胞功能紊亂和自身免疫性疾病的病理進程。研究[8-9]表明，包括IL-6、TNF-α在內的細胞因子，通過TLR7/TLR9信號通路激活的樹突狀細胞分泌參與類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的發生發展。目前，細胞因子參與自身免疫性疾病是一個快速發展的生物學和臨床研究領域，以細胞因子、受體和信號分子為治療靶點的靶向制劑研究取得了較大進展。

芳香烴受體 (AhR)是 HLH超家族PAS亞家族一種配體激活啟動型轉錄因子，也是細胞信號通路的調節子。AhR不僅可介導芳香烴類化合物的毒性反應，還參與一些重要的生物學過程，其中AhR在免疫系統中的作用日益被關注。Nature等雜志發表的多項研究[10-11]表明，AhR是調控Th17和Treg細胞分化和功能的重要因素，且可能是初始T細胞分化成Treg細胞對抗Th17細胞的中心環節。類風濕性關節炎AID動物模型的研究[2,11]表明，AhR基因缺陷能減輕膠原誘導的小鼠類風濕性關節炎的發展和減少Th17細胞數比例。Kado等[12]研究報道，AhR調節TLRs誘導人單核細胞衍生DC(MoDC)中細胞因子和DCs特異性表面標志物的表達。多種AhR配體差異地修飾人MoDC中的細胞因子表達。為進一步研究AhR在自身免疫中的病理生理作用，本研究利用AhR基因敲除小鼠，依據樹突狀細胞的TLRs激活機制選擇與自身免疫性疾病細胞因子生成相關的TLR7/TLR9激動劑Imiquimod、CpG-A、CpG-B體外刺激小鼠脾臟樹突狀細胞，研究TLR7/9介導的脾臟DCs分泌細胞因子變化，探討AhR對DCs免疫調節作用的影響。結果顯示，AhR基因敲除小鼠脾臟DCs分泌的炎性細胞因子IL-6、TNF-α的mRNA表達和生產水平較野生鼠明顯受到抑制。IL-6、TNF-α是參與AID發生發展的主要細胞因子，提示AhR轉錄因子參與DCs的免疫調節作用并可能涉及AID發病機制。Nguyen等[11]研究表明，AhR基因缺陷通過依賴犬尿氨酸(kyn)負調節DCs介導的免疫功能減少了激動劑LPS或CpG-B刺激小鼠骨髓來源樹突狀細胞(BMDC) 的IL-10分泌。本研究結果與Kado等[12]的結果也有一致性。

AhR參與DCs的TLRs介導免疫調節作用機制復雜且未完全明了。AhR信號通路的調控主要通過其激動劑或抑制劑與AhR結合，誘導或抑制其變構入核而啟動下游信號轉錄。已發現多種外源性的化學物質及物理因素，如二噁英家族、多氯聯苯、苯并芘及日光等作為AhR的外源性配體，激活AhR下游信號途徑如細胞色素P450家族，誘導相關外源性毒性理化物質的生物學效應[13]。后期的研究將以此為基礎進一步展開，以AhR為中心環節，探討DCs的AhR信號通路靶點干預、研究DCs的免疫功能及解析其機制以應用于AID治療。

綜上所述，本研究初步探討了轉錄因子AhR對小鼠脾臟DCs免疫功能的影響，AhR及其信號通路可能通過影響TLR7/9介導的樹突狀細胞分泌IL-6、TNF-α的改變涉及AID發病機制。