野生蔓越莓活悅飲的制備及其體內抗氧化功能研究

石 杰，李寶龍， 劉宇峰，王嬌嬌，段婷婷，董 艷

（1. 黑龍江省科學院 大慶分院，黑龍江 大慶 163319；2. 黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040）

0 引言

野生蔓越莓（Vaccinium Vitis-idaeaL.） 屬于杜鵑花科越橘屬植物，又名牙疙瘩、紅豆、紅果，分布于東亞、北美、北歐的高山地帶[1-2]。通過查閱中華藥典，根據藥性相生相克研制出了針對女性日常引用的功能飲品——野生蔓越莓活悅飲。以野生蔓越莓凍果榨汁去果膠為基礎飲料，將野生蔓越莓與馬來西亞國寶——卡琪花蒂瑪、紅花、枸杞提取物進行配伍，輔以蔗糖、木糖醇或三氯蔗糖制備而成的功能型無醇果汁飲品，不添加任何防腐劑，具有濃郁的蔓越莓果香和酸甜清涼的草本口味，色澤紅潤明亮、質量穩定、口感爽滑細膩、營養價值高，具有增強女性免疫能力、改善內分泌紊亂、提高女性性功能、提神醒腦、預防婦科炎癥、細膚美顏等作用。

1 材料與試劑

1.1 野生蔓越莓活悅飲的制備

野生蔓越莓，大興安嶺冰莓莊園生物發展有限公司提供；紅花、枸杞，購買于藥店；卡琪花蒂瑪的干燥根葉，購買于馬來西亞；果膠酶、礦泉水，均為食品級。

1.2 飲料抗氧化性試驗

試驗動物：SPF 級ICR 小鼠60 只，遼寧長生生物技術有限公司提供，試驗動物許可證號：SCXK（遼） 2015- 0001。

試驗條件：黑龍江中醫藥大學實驗動物中心（屏障環境），許可證號：SYXK （黑） 2016- 004，溫度21～25℃，濕度40%～70%。SPF 級試驗動物飼料，北京科澳協力飼料有限公司提供，許可證號：SCXK（京） 2014- 0010。

1.3 急性、毒性研究

（1） 受試物。野生蔓越莓活悅飲（原花青素含量為4.629 66 mg/mL），溶于水，穩定。供試品采用蒸餾水配制，配制頻率為試驗當天配制1 次，配制提供樣品的3 倍濃縮液。

（2） 試驗動物。Wistar 大鼠，SPF 級，雌雄各半，共20 只，初始體重范圍為90～100 g，使用時體重范圍118.5～129.0 g，遼寧長生生物技術股份有限公司提供（動物合格證號： SCXK- （遼） 2015-0001）。動物購入后，首先進行預分籠，給一個臨時預分號并測定購入日體重。從購入日算作第1 天，檢疫與馴化期共為7 d。期間對于外觀、狀態出現異常，可能對試驗有影響的動物在試驗時剔除[3]。分組方法：雌、雄動物禁食16 h 后分別按體重分組；識別方法：檢疫馴化期采用尾部標記動物編號，正式試驗采用皮毛標記編號，并在籠具上標明試驗研究號、組別、性別及籠號。

（3） 試驗動物飼養管理的環境條件。飼養室采用屏障系統，溫度設定21～25 ℃，濕度設定40%～70%，換氣次數10～20 次/ h，晝夜明暗交替時間12/12（6:00～18 :00 采用動物照明控制系統）。

（4） 飼養條件。籠具為PC 聚碳酸酯鼠盒（長×寬× 高= 40 cm×25.5 cm×20 cm），飼養密度5 只/盒，籠具交換2 次/ 周，糞便處理需要更換鼠盒及墊料（周一、周四），每天全部試驗結束后，由動物室人員進行常規消毒。

（5） 飼料及飲用水。全價顆粒飼料由北京科澳協力飼料有限公司提供，鈷60 輻照滅菌自由攝取。飲用水采用高壓滅菌自來水，由動物飲水瓶自由攝取，經檢測符合城市飲用水標準。

2 儀器與設備

破碎機、超聲波儀、鼓風干燥箱、連續光譜酶標儀、可見光分光光度計、微量加樣器、恒溫水浴鍋、離心機、組織勻漿器；丙二醛（MDA） 測定試劑盒、還原型谷胱甘肽（GSH） 測定試劑盒、蛋白質羰基測定試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD） 測定試劑盒、蛋白定量測試盒，均由南京建成生物技術有限公司提供。

3 研究方法

3.1 野生蔓越莓果膠處理試驗

試驗采用單因素試驗設計，設置3 個處理：①野生蔓越莓凍果50 g + 果膠酶0.32 g + 常溫過夜；②野生蔓越莓凍果50 g + 果膠酶0.32 g + 50 ℃0.5 h + 常溫1 h；③野生蔓越莓凍果50 g + 果膠酶0.32 g + 常溫過夜+ 50 ℃1.5 h。觀測果汁澄清度[4]。

3.2 野生蔓越莓活悅飲制備

紅花按照日推薦量為3 g，枸杞按照日推薦量5 g，原花青素按照日推薦量100 mg，野生蔓越莓原花青素含量為0.827 3%，推算后為12 g 進行配比制備。該野生蔓越莓無醇活悅飲日推薦量為25 mL。

3.2.1 紅花提取物的制備

稱取紅花23.16 g，以1∶1 的體積比浸泡于桶裝礦泉水中1 h，于65 ℃下超聲處理0.25 h 后過濾，收集濾液后以1∶1 的體積比加入桶裝礦泉水于紅花殘渣中，繼續于65 ℃下超聲處理0.25 h 后過濾，反復3 次，分別收集濾液和殘渣。

3.2.2 枸杞提取物的制備

稱取枸杞38.60 g，以1∶2 的體積比浸泡于桶裝礦泉水中1 h，于65 ℃下超聲處理0.25 h 后過濾，收集濾液后以1∶2 的體積比加入桶裝礦泉水于枸杞殘渣中，繼續于65 ℃下超聲處理0.25 h 后過濾，反復3 次，分別收集濾液和殘渣。

3.2.3 卡琪花蒂瑪提取物的制備

稱取卡琪花蒂瑪根葉混合物39.70 g，采用泰斯特萬能粉碎機（型號FW100） 進行粉碎，以1∶2 的體積比浸泡于75%的食用酒精中1 h，于65 ℃下超聲處理1 h 后過濾，收集濾液后再以1∶2 的體積比加入75%的食用酒精于殘渣中，繼續于65 ℃下超聲處理1 h 后過濾，反復5 次，收集濾液共1.5 L。濾液采用上海申勝生物技術有限公司生產的旋轉蒸發儀（型號R201） 進行濃縮，溫度50 ℃，轉速45 r/min。濃縮后體積約為100 mL。置于鼓風干燥箱中50 ℃下風干，獲得提取物固形物，使用研缽磨碎收集。

3.2.4 野生蔓越莓凍果前處理

稱取野生蔓越莓凍果1 403 g，解凍捏碎，按照0.3%的比例加入果膠酶混合過夜，于50 ℃下水浴0.5 h，得果碎混合物[5]。

3.2.5 野生蔓越莓活悅飲原汁的制備

將果膠酶處理后的野生蔓越莓果碎混合物與3.2.1，3.2.2 中收集的紅花、枸杞濾渣混合，加入新鮮洗凈的薄荷葉10 片左右，使用JYZ- V911 型榨汁機加入3.2.1，3.2.2 中收集的紅花、枸杞濾液榨汁約2 L 進行榨汁，分別收集汁液及果渣。向果渣中加入0.8 L 桶裝礦泉水再次榨汁，收集汁液與之前汁液混合，棄去果渣。在汁液中加入7 g 卡琪花蒂瑪提取物固形物粉末混勻，此即為野生蔓越莓活悅飲原汁[6]。

3.2.6 調配

采用200 目濾布過濾野生蔓越莓活悅飲原汁。原汁按照不同飲用需要分別使用3 個不同糖分添加量及添加方式。

3.3 飲料抗氧化性試驗

3.3.1 D - 半乳糖氧化損傷模型建立

選25～30 g 健康成年小鼠，除空白對照組外，其余動物用D - 半乳糖1.0 g/kg·bw 腹腔注射造模，注射量為0.1 mL/10 g，每日1 次，連續造模6 周，取血測MDA，按MDA 水平分組，隨機分為1 個模型對照組和3 個受試樣品劑量組。

3.3.2 劑量設計分組及受試樣品給予時間

試驗設高、中、低3 個劑量組，分別為人體推薦量的5 倍，10 倍和30 倍，即11.023，22.046，66.138 g/kg·bw。準確稱取野生蔓越莓活悅飲混勻定容至20 mL，分別作為高、中、低3 個劑量經口給予受試小鼠。另設空白對照組和模型對照組，共5 組，每組12 只。空白對照組和模型對照組均給予等容積蒸餾水，試驗小鼠按體重的2%灌胃容積進行灌胃[7]，在給受試樣品的同時，模型對照組和各劑量組繼續給予相同劑量D - 半乳糖腹腔注射，每日1 次，連續灌胃30 d 后處死動物，測血清及肝組織中脂質氧化產物丙二醛（MDA） 含量、抗氧化物質還原型谷胱甘肽（GSH） 含量、蛋白質氧化產物蛋白質羰基含量及抗氧化酶指標中超氧化物歧化酶（SOD） 活力[8]。

3.3.3 丙二醛（MDA） 含量測定

按試劑盒的要求測血清及10%肝均漿中MDA含量[9]。

①血清（漿） 中MDA 含量。

樣品測試前稀釋倍數.

注：樣本測試前稀釋倍數= 上清液制備時稀釋倍數 （5 倍）。

②組織中MDA 含量。

待測樣本蛋白濃度（mgprot/ml） .

注：*nmol/mgprot 為納摩爾/ 毫克蛋白。

3.3.4 還原型谷胱甘肽（GSH） 含量測定

按試劑盒的要求測血清及10%肝均漿中GSH含量[10]。

①血漿中GSH 含量。

GSH 分子量（307）×樣品測試前稀釋倍數

注：標準品濃度為20 μmol/L=20×10-6mol/L；樣本測試前稀釋倍數= 上清液制備時稀釋倍數（5 倍）。

②組織中GSH 含量。

GSH 分子量（307）×樣本測試前稀釋倍數÷

待測勻漿蛋白濃度（gprot/L） .

注：樣本測試前稀釋倍數= 上清液制備時稀釋倍數 （5 倍）

3.3.5 蛋白質羰基含量測定

按試劑盒的要求測血清及10%肝均漿中蛋白質羰基含量[11]。

①血清（漿） 中蛋白質羰基含量。

②組織中蛋白質羰基含量。

3.3.6 超氧化物歧化酶（SOD） 活力測定

按試劑盒的要求測血清及10%肝均漿中SOD活力[12]。

注：mgprot* 為毫克蛋白數。

3.3.7 蛋白質定量測試（考馬斯亮藍法）

按試劑盒的要求測血清及10%肝均漿中蛋白含量[13]。

3.3.8 試驗數據處理

用Excel 軟件建立數據庫，用SPSS 軟件進行方差分析，需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗。計算F 值。F 值＜F0.05，結論為各組均數間差異無顯著性；F 值≥F0.05，p≤0.05，再用多個試驗組和一個對照組間均數的兩兩比較方法進行統計。對非正態或方差不齊的數據進行適當的變量轉換，待滿足正態或方差齊性要求后，用轉換后的數據進行統計[14]。

3.4 飲料急性毒性試驗

（1） 灌胃途徑及方法。禁食16 h 后灌胃給予[15]。

（2） 灌胃劑量。設一個劑量組。

劑量設計見表1。

（3） 劑量設計理由。根據預試驗結果（按設計劑量未測得LD50），以允許的最大質量濃度（10 倍原液濃縮） 及動物最大灌胃容積1 次，7 d 內無一死亡，未見毒性反應，進行最大劑量測定。

表1 劑量設計

（4） 灌胃頻率。分組當天給1 次。

（5） 觀察內容。觀察動物體重、精神狀態、毛色、呼吸、自主活動、飲食、二便、口鼻分泌物，以及死亡和恢復的時間等[16]。

（6） 觀察例數。灌胃后全部試驗動物。

（7） 觀察次數。灌胃后4 h 內連續觀察，然后每天上下午各觀察1 次，連續觀察14 d。

（8） 體重測定方法。采用 “BMS420.3 型電子天平（上海卓精產品）” 測定。

（9） 體重測定例數。灌胃前全部購入動物，灌胃后全部試驗動物。

（10） 體重測定次數。購入日、動物分組（灌胃第1 天） 時、灌胃后每2 d 各測定1 次。

（11） 解剖方法。動物脫臼處死后，進行解剖。剖檢時對動物外表、全身各臟器進行肉眼觀察。若發現異常則作組織病理學檢查。

（12） 解剖時間。動物死亡后即刻及整個試驗觀察結束。

（13） 解剖例數。灌胃后全部試驗動物。

體重采用Microsoft 公司Excel 軟件進行統計。

4 結果與分析

4.1 野生蔓越莓果汁澄清試驗

試驗主要采用果膠酶及作用時間的調試，發現0.64%果膠酶添加量，常溫過夜后于50 ℃下加熱90 min 可以得到較澄清的蔓越莓果汁。

野生蔓越莓果汁澄清試驗見表2。

表2 野生蔓越莓果汁澄清試驗

4.2 過氧化損傷模型的建立，D - 半乳糖造模后小鼠血清中MDA 含量的影響

D - 半乳糖造模后小鼠血清中MDA 含量的影響見表3。

由表3 可見，以D - 半乳糖1.0 g/kg·bw 每日腹腔注射造模6 周后，模型組小鼠血清中MDA 含量明顯增加，與空白對照組比較差異有極顯著性（p＜0.01），說明過氧化損傷模型成立。

表3 D - 半乳糖造模后小鼠血清中MDA含量的影響（X±SD）

4.3 野生蔓越莓活悅飲對過氧化損傷模型小鼠MDA的影響

野生蔓越莓活悅飲對小鼠血清及肝組織中MDA含量的影響見表4。

表4 野生蔓越莓活悅飲對小鼠血清及肝組織中MDA 含量的影響 （X±SD）

由表4 可見，與模型對照組比較，中、高劑量組小鼠血清和肝組織中MDA 的含量差異均有顯著性（p＜0.05 或p＜0.01）[16]。

4.4 野生蔓越莓活悅飲對GSH 的影響

野生蔓越莓活悅飲對小鼠血清及肝組織中GSH含量的影響見表5。

表5 野生蔓越莓活悅飲對小鼠血清及肝組織中GSH 含量的影響 （X±SD）

野生蔓越莓活悅飲果汁樣品中原花青素含量為4.629 66 mg/mL。研究表明，原花青素人體推薦使用量為2.204 6 mg/kg·bw。人體標準體重為60 kg，每天喝132.276 mg/d，相當于28.57 mL。

由表5 可見，與模型對照組比較，高劑量組血清和中、高劑量組肝組織中還原型谷胱甘肽差異均有顯著性 （p＜0.05 或p＜0.01）。

4.5 野生蔓越莓活悅飲對蛋白質羰基的影響

野生蔓越莓活悅飲對小鼠血清及肝組織中蛋白質羰基含量的影響見表6。

由表6 可見，與模型對照組比較，各劑量組小鼠血清及肝組織蛋白質羰基含量差異均無顯著性（p＞0.05）[17]。

表6 野生蔓越莓活悅飲對小鼠血清及肝組織中蛋白質羰基含量的影響（X±SD）

4.6 野生蔓越莓活悅飲對SOD 活力的影響

野生蔓越莓活悅飲對小鼠血清及肝組織中SOD活力的影響見表7。

由表7 可見，與模型對照組比較，中、高劑量組血清和肝組織中SOD 活力差異均有顯著性（p＜0.05或p＜0.01）。

表7 野生蔓越莓活悅飲對小鼠血清及肝組織中SOD 活力的影響 （X±SD）

4.7 野生蔓越莓活悅飲對過氧化損傷模型小鼠體重的影響

野生蔓越莓活悅飲對小鼠體重（g） 的影響見表8。

由表8 可見，給予受試物30 d，各劑量組小鼠的體重與模型對照組比較差異均無顯著性（p＞0.05）[18]。

表8 野生蔓越莓活悅飲對小鼠體重（g） 的影響（X±SD）

4.8 急性毒性研究中體重變化

在試驗中，試驗前和試驗結束時各受試動物體重均呈一定程度的增長，說明該供試品灌胃后未影響受試動物生長[19]。

對大鼠體重的影響見表9。

表9 對大鼠體重的影響（X±S，n=10）

4.9 急性毒性研究中毒性反應

在灌胃后直至試驗結束，大鼠一般狀態良好，毛順光亮，活動和飲食正常，糞便成型。無一動物死亡。

4.10 急性毒性研究中解剖所見

試驗結束次日，所有動物均進行了大體解剖觀察，肉眼未發現器官出現體積、顏色、質地等改變，特別觀察了心、肝、脾、肺、腎、腦、胃腸等重要臟器。檢查結果未見出血、充血、滲出、潰瘍、穿孔、炎癥，胸腔、腹腔及心包腔均無積液。

4.11 急性毒性研究中大鼠最大灌胃量

（1） 大鼠最大灌胃量測定。結果表明，動物數20只，給藥質量濃度46.3 mg/mL，每次給藥容積2 mL/100 g，給藥次數1 次/ d，給藥劑量6 g/kg，觀察時間14 d，無死亡。

（2） 微生物指標測定。根據GB 4789.2—2010 食品菌落總數標準測定野生野生蔓越莓活悅飲的細菌總數（CFU/g） ≤10 個/mL，并且未檢出致病菌。

（3） 野生蔓越莓活悅飲保質期測定。于2017 年5 月份制備的野生野生蔓越莓活悅飲在自然條件下貯存12 個月，未發現沉淀物和其他任何異常現象。同時測定了菌落總數，結果仍為（CFU/g） ≤10 個/mL，可見蔓越莓具有很強的抑制細菌的性能。

5 結論

0.64 %果膠酶加入量，常溫過夜后于50 ℃下加熱90 min 可以得到較澄清的蔓越莓果汁。根據原花青素、紅花、枸杞、卡琪花蒂瑪的日推薦量配比制備了野生蔓越莓活悅飲。

經口給予過氧化損傷模型小鼠66.138，22.046，11.023 g/kg·bw（相當于人推薦劑量的30 倍，10 倍，5 倍） 野生蔓越莓活悅飲30 d，可明顯降低血清及肝組織的脂質氧化產物丙二醛（MDA） 含量，升高血清、肝組織抗氧化產物還原型谷胱甘肽（GSH） 含量及血清、肝組織的超氧化物歧化酶（SOD） 活力，與對照組比較差異有顯著性（p＜0.05）。根據 “關于印發抗氧化功能評價方法等9 個保健功能評價方法的通知” 中的判定標準，認為野生蔓越莓活悅飲具有抗氧化功能。

因受質量濃度及灌胃容積的限制，無法測得大鼠的LD50。大鼠灌胃最大灌胃量為936 mg/kg，相當于人體使用劑量2.06 mg/kg 的450 倍。根據以上幾點，可以認為野生蔓越莓活悅飲毒性較小、安全。