MALDI-TOF MS技術在非結核分枝桿菌鑒定及分型中的應用價值

蘇琦

(焦作市疾病預防控制中心 結防科， 河南 焦作 454150)

非結核分枝桿菌(nontuberculoaus mycobacteria，NTM)與結核分枝桿菌復合群(M.tuberculosis-complex，MTC)感染的治療方式完全不同，故鑒定NTM與MTC對指導治療具有重要意義。我國于2016年出版的相關專家共識指出，NTM目前已超過170種，其中約1/3與人類感染性疾病有關[1]。可見鑒定不同類型的NTM對擬定治療方案同樣重要。抗酸染色是實驗室診斷分枝桿菌的常用方式，但抗酸染色容易出現漏檢現象，且鑒定NTM與MTC易受到其他細菌的干擾[2-3]。雙重引物聚合酶鏈反應(duplex polymerase chain reaction，Duplex-PCR)是鑒定NTM與MTC的金標準，但Duplex-PCR耗費高、操作復雜、對技術人員要求高，且對于不同類型NTM的PCR測序引物也缺少統一標準[4]。基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)是一類簡單、快捷的微生物學檢測技術，在分枝桿菌以外的多種細菌鑒定中已得到充分應用。基于此，本研究分析MALDI-TOF MS在NTM鑒定及分型中的應用價值，旨在為分枝桿菌的實驗室診斷提供指導。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性分析2017年1月至2019年4月焦作市疾病預防控制中心結核分枝桿菌培養與抗酸染色陽性的菌株資料，排除重復菌株(取自相同時間、相同患者)后，以剩余的98株菌株作為研究對象。來源：痰液48株，肺泡灌洗液20株，胸腹水8株，腦脊液7株，膿液7株，關節液3株，尿液3株，病理組織2株。

1.2 檢測方法(1)MALDI-TOF MS：對菌株行常規生物滅活，水浴加熱分枝桿菌培養管30 min，離心處理后去除上清液、留取沉淀。洗滌3次后渦旋震蕩重懸菌體，離心處理后去除上清液、留取沉淀。加無水乙醇與去離子水，靜置5～10 min，離心后去除上清液、留取沉淀。加0.5 mm玻璃珠，根據菌體體積加乙腈，震蕩5～10 min。加與乙腈等體積的體積分數為70%的甲酸溶液，震蕩后離心處理，取上清液于質譜靶板，晾干后加α-氰-4-羥基苯丙烯酸基質溶液，再次晾干后采用MALDI-TOF MS儀器(德國布魯克公司)鑒定菌株，通過數據庫匹配鑒定結果。儀器說明書提示，鑒定分數<1.5分為結果不可信。(2)Duplex-PCR：標本置于加熱器中煮沸裂解，冷卻后離心處理，取上清液置于無菌離心管中，-80 ℃低溫保存。每次配制PCR預混液100份，混勻后分別置于96孔板孔中，而后將實驗菌株DNA模板分別置于孔中，記錄后置于PCR儀器(美國BioBad公司)中擴增。采用瓊脂糖凝膠電泳PCR擴增產物，采用100BP DNA LadderMarker(成都擎科梓熙生物技術有限公司)測定相對分子質量。以H37 Rv對應PCR擴增產物為陽性對照，以去離子水為陰性對照，采用Gel DocXR型成像儀(美國BioBad公司)分析電泳結果。結果示235 bp條帶的為MTC，136 bp條帶的為NTM，若無條帶則重復試驗。(3)基因測序：對培養的標準菌株、臨床陽性培養菌株進行高壓滅菌，取混懸液1 mL煮沸裂解，而后以12 000 r·min-1的速率離心處理5 min，將上清液于-80 ℃下保存。對Duplex-PCR鑒定出的NTM進行擴增測序，引物包括TB28S與TB264。PCR擴增體系：離子水13 μL，Master Mix 25 μL×2(成都擎科梓熙生物技術有限公司)，2種引物各1 μL，DNA模板10 μL，記錄后采用PCR儀器進行擴增。

1.3 評價指標(1)以Duplex-PCR為金標準，計算MALDI-TOF MS鑒定NTM的準確度、靈敏度、特異度及陽性預測值、陰性預測值。真陽性例數：兩種方式均鑒定為NTM的例數；假陽性例數：MALDI-TOF MS鑒定為NTM而Duplex-PCR鑒定為MTC的例數；假陰性例數：Duplex-PCR鑒定為NTM而MALDI-TOF MS鑒定為MTC的例數；真陰性例數：兩種方式均鑒定為MTC的例數。(2)以基因測序為金標準，計算MALDI-TOF MS鑒定NTM分型的符合率。

1.4 統計學方法采用SPSS 23.0統計軟件處理數據，以百分比表示計數資料，采用Kappa檢驗MALDI-TOF MS鑒定結果與金標準的一致性，Kappa>0.74表示一致性高，0.4～0.74表示一致性中等，<0.4表示一致性低。

2 結果

2.1 MALDI-TOF MS鑒定NTM的效能分析MALDI-TOF MS鑒定NTM的準確度94.90%，靈敏度90.00%，特異度96.15%，陽性預測值85.71%，陰性預測值97.40%。見表1。MALDI-TOF MS鑒定結果與金標準的一致性Kappa值為0.846，一致性高。

表1 MALDI-TOF MS鑒定NTM的效能分析(n)

2.2 MALDI-TOF MS鑒定NTM分型的效能分析20例NTM中，基因測序鑒定出膿腫分枝桿菌14例，隱藏分枝桿菌、福西亞分枝桿菌、馬賽分枝桿菌各2例。1例馬賽分枝桿菌未能被MALDI-TOF MS鑒定出(鑒定分數<1.5分)，其余鑒定結果均與金標準相符合，符合率95.00%。

表2 MALDI-TOF MS鑒定NTM分型的效能分析(n)

3 討論

NTM可引起結核樣病變，其能耐受常用的抗結核藥物，與結核分枝桿菌相比，對生長環境的要求較為寬松[5]。因此，NTM對人類的危害巨大，加之NTM感染與MTC感染的治療存在較大差異，故及時、準確地鑒定NTM與MTC對保障治療的有效性、安全性意義重大。

目前，Duplex-PCR仍是鑒定NTM與MTC的金標準，但該技術在實際應用中具有較大局限，如Duplex-PCR耗費高、操作復雜、對技術人員要求高；不同分型NTM的PCR測序引物不同，導致實驗室測序方案不統一；Duplex-PCR的檢測時間較長，不利于疾病的早期治療[6-7]。因此，探索新的NTM鑒定手段顯得愈發重要。近年來，國內已有關于MALDI-TOF MS應用于細菌鑒定、細菌分型、毒力檢測的報告，均顯示該技術鑒定細菌的準確度高，且具有操作簡單、耗時短的優點[8-9]。但目前關于MALDI-TOF MS用于鑒定NTM及NTM分型的報告較少。本研究結果顯示，MALDI-TOF MS鑒定NTM的準確度、靈敏度、特異度較高，提示MALDI-TOF MS能有效鑒別NTM與MTC，可用于NTM的實驗室診斷。質譜鑒定原理為分析蛋白獲取細菌蛋白指紋圖譜，而后通過算法同數據庫進行匹配，最終將與數據庫高度相似的作為鑒定結果并以分值形式體現[10]。因此，數據庫容量對MALDI-TOF MS的鑒定準確度具有較大影響。本研究中，MALDI-TOF MS鑒定NTM的結果中有3例假陽性，2例假陰性。數據庫不夠完善是發生鑒定錯誤的重要原因，而分枝桿菌在傳代過程中容易因細胞壁丟失而發生變異，導致蛋白結構改變，故應選用新傳代菌落的蛋白來完善數據庫[11]。本研究還顯示有1例馬賽分枝桿菌未能被MALDI-TOF MS鑒定出，但其余鑒定結果均與金標準相符合，提示MALDI-TOF MS能有效鑒定NTM分型。此外，本研究屬于回顧性分析，樣本的選取受到一定限制，且NTM的分型眾多而本研究只發現了其中4類，故MALDI-TOF MS鑒定NTM及其分型的價值，仍有待未來展開大樣本的前瞻性研究做出進一步分析。

綜上所述，MALDI-TOF MS技術能準確鑒定NTM及NTM分型，在NTM的實驗室診斷中具有較高應用價值。