甲基丙烯酸酐化明膠水凝膠介導的骨髓間充質干細胞增強肩袖損傷后愈合的研究

CHEONG Sou San(張素珊) 李赟 于貞成 趙丹陽 崔巖 曹怡 韓冬

由急性外傷或慢性退行性病變引起的肩袖損傷在臨床較為常見。大多數肩袖損傷發生在肌腱與骨的界面附近，主要表現為肌腱止點處骨骼的礦物質流失和界面纖維軟骨的無法再生[1-3]。肩袖具有復雜的解剖結構，使臨床治療肩袖損傷的效果非常有限，恢復肩袖的解剖結構與功能是亟待解決的難題。

肌腱是通過纖維或纖維軟骨止點附著在骨上，而肩袖損傷時通常是纖維軟骨止點的撕裂[4]，而纖維軟骨的無法再生成為了肩袖難以愈合的關鍵問題。近年來，隨著對肌腱和骨愈合生物學機制的深入研究，用于加強腱-骨愈合的新的組織工程技術也有了一定發展。骨髓間充質干細胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)具有較強的多分化潛能，可能是修復腱-骨界面的理想種子細胞，Ouyang等[5]的研究證明了BMSCs能改善腱-骨止點的愈合。此外，應用BMSCs治療肩袖損傷的實驗表明，軟組織和骨之間整體的接觸區域是愈合的主要決定因素[6]，提高接觸區域的面積也是當前的研究熱點。甲基丙烯酸酐化明膠(Gelatin methacrylate，GelMA)是一種光敏性生物水凝膠材料，具有良好的生物相容性，能為干細胞提供類似于天然細胞外基質的生長環境，并具有快速成膠性，可有效包裹大量細胞，故成為了一種優良的細胞載體。另外，GelMA來源廣泛，液體形式可填充各種結構的缺損，對于復雜的肩袖結構，能達到提升整體愈合接觸面的目的[7-9]。因此，GelMA水凝膠是一種理想的組織工程材料[10]。為解決肩袖愈合的難題，本研究擬將GelMA包裹具有多種分化潛能的BMSCs后加載至腱-骨損傷界面，觀察BMSCs/GelMA水凝膠應用于肩袖損傷后對腱-骨愈合的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

低糖DMEM培養基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗、0.25%胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液(Gibco，美國)；大鼠BMSCs成骨、成脂和成軟骨誘導分化培養基試劑盒(廣州賽業生物科技有限公司)；甲基丙烯酸酐化明膠、LAP光引發劑(蘇州永沁泉智能設備有限公司)；CCK-8試劑盒(Dojindo，日本)；活/死細胞雙染色試劑盒(KTA1001，武漢Abbkine生物技術公司)；Actin-Tracker Green微絲綠色熒光探針(C1033，上海碧云天生物技術有限公司)；蘇木素-伊紅染色試劑盒、Masson三色染色液、改良番紅O-固綠軟骨染色液(北京索萊寶科技有限公司)；PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒、TB Green?Premix Ex TaqTM試劑盒(TaKaRa，日本)。

酶標儀(Synergy H1，BioTek，美國)；倒置相差顯微鏡(TS2，Nikon，日本)、正置光學顯微鏡(Eclipse E100，Nikon，日本)、激光共聚焦顯微鏡(ECLIPSE Ti，Nikon，日本)；實時定量PCR儀(ABI7500，ABI，美國)；生物力學測定儀(Instron，美國)。

1.2 BMSCs分離與培養

實驗動物選取近交系Wistar大鼠(上海甲干生物科技有限公司)，2周齡，雄性，本研究動物實驗均遵守相關實驗動物倫理要求。無菌條件下完整取出后肢的股骨和脛骨，剪去骨干兩端，沖洗骨髓腔，收集沖洗液至培養皿，加入完全培養基(含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的低糖DMEM培養基)，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養箱中靜置培養。每3 d換液一次，鏡下觀察細胞生長情況，達80%聚集后傳代。取第2、3代細胞備用。

1.3 克隆形成能力檢測

為檢測培養細胞是否具有干細胞的自我更新潛能，取第2代培養細胞檢測其克隆形成能力。以10個/cm2的細胞密度接種于6孔培養板，加入完全培養基常規培養。第14天時終止培養,鏡下觀察確認細胞克隆形成，細胞固定后用0.5%w/V結晶紫染色，待干燥后拍照觀察細胞集落數。

1.4 三系分化鑒定

取第2代細胞進行三系分化鑒定。成骨分化：按2×104個/孔的細胞密度接種于6孔板，實驗組(n=3)加入成骨誘導分化完全培養基，對照組(n=3)使用完全培養基，誘導培養21 d后，加入茜素紅染液并鏡下觀察。成脂分化：以2×104個/孔接種于6孔板，實驗組(n=3)加入成脂誘導分化培養基，對照組(n=3)加完全培養基，培養21 d后加入油紅O染色，鏡下觀察。成軟骨分化：按2×104個/孔的細胞密度接種于6孔板，實驗組(n=3)加入成軟骨誘導分化完全培養基，對照組(n=3)加完全培養基，誘導培養21 d后，加入阿利新藍染液染色，鏡下觀察。

1.5 構建BMSCs/GelMA水凝膠

先將GelMA凍干粉溶解于PBS溶液中制得10%w/V的工作液，光引發劑Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate(LAP)粉末溶解于PBS溶液中制得0.5%w/V的工作液。取第3代BMSCs加入GelMA溶液，使最終細胞密度為1×107個/mL，而GelMA和LAP的終濃度分別為5%w/V和0.1%w/V。吹打混勻后，吸取30 μL含BMSCs的GelMA溶液至圓孔模具中，迅速以405 nm藍光照射20 s進行光交聯固化；成膠后，將BMSCs/GelMA水凝膠小心轉移至48孔培養板，加入完全培養基后置于CO2培養箱中。

1.6 BMSCs/GelMA水凝膠的細胞增殖檢測

BMSCs/GelMA水凝膠在體外培養1、3、5和7 d時，分別行CCK-8法測定細胞增殖情況。按照培養基∶CCK-8=10∶1的比例，向每孔中加入一定量的CCK-8溶液，孵育4 h后，取10 μL上清液轉移至96孔板中，用酶標儀檢測450 nm處的光密度。每個時間點樣本量為3個。

1.7 BMSCs/GelMA水凝膠的細胞形態檢測

微絲綠色熒光探針(Actin-Tracker Green)是結合發綠色熒光FITC的鬼筆環肽溶液。在BMSCs/GelMA水凝膠體外培養第7天時，以4%多聚甲醛固定1 h，再使用Actin-Tracker Green進行細胞骨架內微絲染色，并用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光染色情況，以檢測GelMA水凝膠中的細胞形態。

1.8 動物實驗

選取36只近交系Wistar大鼠(8周，雄性)進行動物實驗。實驗分為3組(n=12)：①BMSCs/GelMA水凝膠組，修復術中加入BMSCs/GelMA水凝膠；②GelMA水凝膠組，修復術中加入GelMA水凝膠；③對照組，僅行修復手術。

手術方法(圖1)：大鼠麻醉后常規消毒，于肩部外側切開皮膚，縱行切開三角肌，仔細解剖顯露肱骨大結節后即找到岡上肌肌腱止點，銳利刀片切斷肌腱止點，并刮除纖維軟骨。5-0 PDS線穿過肌腱斷端，以23 G針頭橫行穿過肱骨頭形成隧道，縫線穿過針頭以通過隧道。縫線打結前，分別于腱-骨止點位置植入BMSCs/GelMA水凝膠或GelMA水凝膠。對照組無植入材料，直接打結固定肌腱斷端于肱骨頭處。最后逐層縫合以關閉切口。術后大鼠前肢活動不受限，手術切口每日消毒護理。術后2、4周時各取材6只進行相關檢測。

圖1 肩袖撕裂動物模型手術示意圖(黑色實線箭頭為岡上肌肌腱，白色箭頭為被針頭穿過的肱骨頭，黑色虛線箭頭為打結前放置的GelMA材料)Fig. 1 The animal model for rotator cuff tears and surgical repair procedure (The supraspinatus tendon indicated by the black solid arrow; The needle through the humeral head indicated by the white arrow; Implanted GelMA denoted by black dotted arrow)

1.9 腱-骨界面組織學檢測

術后4周時，每組取樣進行組織學檢測(n=4)。完整取下肩袖關節后，除保留岡上肌肌腱，其余肌腱和韌帶完全去除，4%多聚甲醛固定后，浸入乙二胺四乙酸二鈉溶液中脫鈣1個月。脫鈣后進行常規脫水和浸蠟包埋，切片(厚度4 μm)，HE染色，觀察細胞修復和界面愈合情況； Masson三色染色，觀察膠原纖維分布情況；番紅O-固綠染色，觀察修復部位的軟骨生成和骨組織形態。

1.10 腱-骨界面相關基因表達檢測

以實時定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reactions，qPCR)檢測腱-骨界面相關基因的表達。選取的基因為肌腱相關基因Scleraxis(Scx)，成骨相關基因runt-relatedtranscriptionfactor2(Runx2)，軟骨相關基因collagentypeⅡ(Col2)和sex-determiningregionY-box9(Sox9)。根據GenBank序列數據庫設計引物(表1)。在術后2周和4周，收集每組的肩袖樣本(n=6)，保留岡上肌肌腱，去除其余肌腱和韌帶，樣本以液氮研磨，加入TRIzol裂解液并提取總RNA，使用PrimeScriptTMRT Master Mix逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA模板，使用TB Green?Premix Ex TaqTM試劑盒進行目的基因擴增。以GAPDH為內參，計算Scx、Runx2、Col2和Sox9基因的相對表達量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.11 腱-骨界面生物力學檢測

在術后4周進行取材(n=6)，獲取肩袖樣本后，保留肱骨和肩胛骨及其上的肌肉，保留岡上肌肌腱，其余肌腱和韌帶完全切斷，獲取標本(圖2)。在Instron力學測定儀上，將肱骨與肩胛骨分別以上、下夾具固定，設定預張力0.1 N，逐漸向上拉伸上夾具，直至肌腱完全斷裂，記錄拉伸過程中肌腱斷裂時的最大抗張力。

圖2 用于生物力學檢測的標本(黑色箭頭所指為岡上肌肌腱止點)Fig. 2 Specimen for biomechanical tests (black arrow indicating supraspinatus tendon insertion)

1.12 統計學分析

2 結果

2.1 BMSCs的克隆形成能力與三系分化鑒定

克隆形成能力：提取的細胞體外培養14 d后，結晶紫染色可見皿底部有多個單細胞克隆形成，肉眼可見直徑大于2 mm的細胞集落分布(圖3)。

圖3 第2代BMSCs克隆形成檢測結果Fig. 3 Colony-forming analysis of P2 BMSCs

三系分化結果顯示：提取細胞經成骨誘導培養并行茜素紅染色，肉眼可見橙紅色的陽性反應，倒置顯微鏡下可見橙紅色鈣結節；成脂誘導并行油紅O染色，鏡下可見脂滴并顯示光亮的圓形脂肪細胞，有的呈現鮮紅色串珠狀；成軟骨誘導培養并行阿利新藍染色，可見細胞質藍染(圖4)。

2.2 BMSCs/GelMA水凝膠的細胞增殖情況

在體外培養1、3、5和7 d，BMSCs/GelMA水凝膠上清液的OD值分別為0.69±0.01、1.22±0.04、1.34±0.04和1.82±0.10，表明GelMA水凝膠中的細胞在培養的7 d內呈增長趨勢，其中第7天比第1天的OD值增加了近3倍(圖5)。

圖4 第2代BMSCs的成骨、成脂和成軟骨分化Fig. 4 Osteogenic, adipogenic and chondrogenic differentiation of P2 BMSCs

圖5 CCK-8檢測BMSCs/GelMA水凝膠的細胞增殖情況Fig. 5 Cell proliferation in BMSCs/GelMA hydrogels detected by CCK-8 assay

2.3 BMSCs/GelMA水凝膠的細胞形態

經過7 d體外培養，對BMSCs/GelMA水凝膠進行細胞骨架Actin染色。激光共聚焦顯微鏡下可觀察到包裹于水凝膠中的BMSCs細胞核藍染(DAPI染色)，細胞骨架發出綠色熒光，細胞伸展較好，形態為多態性，多呈單層生長(圖6)。

圖6 體外培養7 d后BMSCs/GelMA水凝膠的細胞骨架微絲染色(500×)Fig. 6 Actin staining of the BMSCs/GelMA hydrogels after cultured 7 days in vitro (500×)

2.4 腱-骨界面組織學檢測

術后4周實驗動物切口已痊愈。HE染色顯示，與其余兩組相比，BMSCs/GelMA水凝膠組纖維軟骨生成較多，在10倍鏡下觀察到軟骨生成明顯，顯示均勻、豐富的纖維軟骨細胞分布。術后4周肌腱仍處于修復狀態，肌腱組織排列無序緊密。Masson三色染色顯示BMSCs/GelMA組和GelMA組均呈現大面積藍染的膠原纖維組織，表明兩組有較豐富的膠原生成和沉積；反之，對照組中藍染相對弱，表明膠原纖維生成相對少。番紅O-固綠染色顯示BMSCs/GelMA組與GelMA組紅色纖維軟骨層清晰可見，表明腱-骨界面之間良好的纖維軟骨再生，而對照組紅色軟骨層較少(圖7)。

圖7 肩袖切片的組織學染色結果(黑色箭頭指向軟骨細胞層；白色箭頭指向膠原纖維組織層；綠色箭頭為處于修復的肌腱)Fig. 7 Histological staining of rotator cuff in cross-section (Black arrows: formation of chondrocytes; White arrows: collagen fibers; Green arrows: tendon being repaired)

2.5 腱-骨界面相關基因表達檢測

qPCR檢測腱-骨界面相關基因在愈合過程中的表達情況，BMSCs/GelMA組與另外兩組相比，Col2的基因表達在術后4周比術后2周高出2倍(P<0.01)。由于術后4周是肩袖損傷后愈合的一個關鍵時刻，Col2基因在術后4周的表達上調提示了腱-骨界面之間纖維軟骨再生能力的提高。此外，在術后2周，與其余兩組相比，BMSCs/GelMA組Scx、Runx2和Sox9基因表達水平均有明顯增加(P<0.05)，說明在肩袖損傷的早期愈合過程中，BMSCs具有潛在的成肌腱、成骨和成軟骨分化能力，即具有良好的腱-骨界面修復能力(圖8)。

*： P<0.05；**： P<0.01圖8 qPCR檢測各組肩袖愈合相關基因表達Fig. 8 qPCR demonstrated mRNA expression levels of rotator cuff healing related genes in each group

2.6 腱-骨界面生物力學檢測

術后4周，測量3組肩袖腱-骨止點斷裂時的最大負荷并進行比較，結果(圖9)顯示： BMSCs/GelMA水凝膠組的最大負荷為(12.435 ± 2.92) N，GelMA水凝膠組為(11.94 ± 2.93) N，對照組為(12.21 ± 2.66) N，3組間無顯著統計學差異(P>0.05)。

圖9 術后4周各組生物力學檢測結果Fig. 9 Results of biomechanical tests in each group 4 weeks after operation

3 討論

由于肩袖多層結構的組織復雜性，肩袖損傷后無法恢復正常分層結構，故難以達到功能性愈合。隨著再生醫學的快速發展，組織工程技術對解決這一臨床難題展現出美好的前景。既往研究表明，肩袖損傷多發生在含纖維軟骨的界面上，其治療目標是防止纖維性瘢痕組織增生和再生纖維軟骨層[11]。在細胞治療中，BMSCs經常被用于加強肩袖愈合，但其治療效果不顯著，分析原因可能是細胞與腱-骨界面的接觸面積不足。

本實驗利用GelMA包裹BMSCs，并將其植入肩袖損傷模型中，以提高BMSCs與腱-骨界面的接觸面積，加大細胞治療的細胞量。結果表明，通過GelMA水凝膠介導的BMSCs顯示出良好的細胞增殖性和細胞形態，能較好地發揮細胞治療效果。GelMA水凝膠主要成分為明膠[12]，與膠原比較，明膠具有更高的溶解性和更低的抗原性，為細胞生長和組織形成提供了良好的微環境。動物實驗中各組指標的檢測印證了BMSCs/GelMA水凝膠的植入促進了腱-骨界面愈合能力。生物力學檢測中，各組未顯示出顯著統計學差異，可能由于觀察的愈合時間還不夠長。

近十余年來，關于細胞與生物材料界面的研究多已轉移到微環境三維立體培養模式。GelMA水凝膠固有的生物活性和快速光交聯的物理化學特性[13]，雖然能快速、有效地將多量細胞轉移至體內，但目前GelMA水凝膠的應用受限于其較低的機械強度，可考慮對其加以修飾，以調節各種特性，例如物理強度、化學性質、電導率和孔隙率等[14]。已證實碳納米管與GelMA復合水凝膠的機械性能可通過控制摻入的碳納米管的比例進行調整[15]。另外，最新研究發現，一種在隱形眼鏡中廣泛使用的生物材料聚甲基丙烯酸2-羥乙酯(pHEMA)能以互相穿插技術摻入負載有角膜細胞的GelMA水凝膠以增強其機械性能，體外測試結果顯示，載有細胞的GelMA/HEMA角膜基質模型具有合適的機械強度[16]。

綜上所述，基于GelMA水凝膠的干細胞治療方法可有效加強肩袖損傷的愈合，但在將來的工作中，要進一步研究如何提高GelMA的機械性能以提升對肌腱-骨的修復，為臨床上組織損傷的治療提供相關實驗基礎。