聚-谷氨酸促進柑橘苗木生長和礦物元素吸收的研究

宗琪，張生才，范國泰，黃奕，胡黨振，姜玲*

（1.華中農業大學農業微生物學國家重點實驗室，湖北，武漢 430070；2.國家現代化產業技術體系，福建永春蘆柑綜合試驗站，福建泉州 362600；3.華中農業大學園藝林學學院，國家果樹脫毒種質資源室內保存中心，農業部華中地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，湖北武漢 430070）

近幾年，PGA 在農業生產上也不斷被開發利用，由于PGA 具有生物可降解性和高吸水性，可以將其應用在沙漠和缺水地區。將PGA 制作成種子包衣材料，種植在沙漠及缺水地區，可以快速發芽。在施用肥料和農藥時，加入適量的PGA，可以延長藥劑的作用時間[2]。PGA 還具有良好的生物降解性，在體內環境下，因酶的生物作用可進一步降解，在自然環境中受微生物的作用也可以降解，具有很好的生物相容性，并且無自身抗原性、可食無毒等優點[3]。PGA 可作為土壤保水劑、肥料增效劑使用，能增強土壤的持水能力，提高肥料的利用率[4]。PGA 在糧食作物和園藝植物如煙草[5]、油菜[6]、水稻[7]、冬小麥[8]、玉米[9-10]、小青菜[11]、葡萄[12]等上的應用已有不少報道，研究發現PGA 可以提高產量、改善品質。迄今為止，PGA 在柑橘苗木上的作用效果還未見報道。為了適應柑橘產業可持續發展的需要，提高柑橘苗木質量，本研究以柑橘實生苗和嫁接苗為試材，采用PGA 單獨處理、PGA 與磷酸二氫鉀和尿素組合處理兩種方案，觀察了柑橘的多項生長、生理指標，并對葉片中的礦物元素含量進行了檢測分析，從而為PGA 在柑橘良種繁育上的應用提供理論依據和技術方面的指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料為強德勒柚實生苗、永春蘆柑嫁接苗。

PGA 由華中農業大學農業微生物學國家重點實驗室提供。丙酮、乙醇、鹽酸、硝酸等均為優級純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

BS210S 萬分之一電子天平，北京SARTORIUS 有限公司；AUW120D 分析天平，沈陽天平儀器有限公司；DHG-9076A 電熱恒溫鼓風干燥箱；KQ-500DV 數控超聲波清洗器；電感耦合等離子體發射光譜儀，安捷倫5100；分光光度計，上海儀器科技有限公司；游標卡尺，北瑞科信北京智能科技有限公司。

1.3 田間試驗設計

1.3.1 強德勒柚實生苗

試驗在華中農業大學國家果樹脫毒種質資源室內保存中心進行。利用強德勒柚新鮮果實，取出種子，去果膠，常規消毒，用自來水洗凈，將種子分成4組，分別用50、100、200 mg/L PGA 溶液和清水（對照）浸泡12 h，剝去外種皮和內種皮，每缽播種5 粒種子，每個處理種10 個培養缽，基質為蛭石。成苗后供后續生長、生理指標測試用。

1.3.2 蘆柑嫁接苗

試驗地點在福建省永春綠源柑橘苗木繁育廠1 號育苗網室，于2017 年3 月8 日進行第一次處理，4 月6日第二次處理，5 月6 日第三次處理，7 月10 日觀察統計數據。

試驗分兩組：第一組2 個處理（A1、B1）和1 個對照（C1）。A1 處理：100 mg/L PGA 灌根，每株200 mL；B1 處理：200 mg/L PGA 灌根，每株200 mL；對照組C1：清水灌根，每株200 mL。第二組2 個處理（A2、B2）和一個對照（C2）。A2 處理：100 mg/L PGA+0.2%KH2PO4+0.2%尿素（Urea）噴施葉面，每株200 mL；B2 處理：200 mg/L PGA+0.2%KH2PO4+0.2%Urea 噴施葉面，每株200 mL；對照組C2：清水噴施葉面，每株200 mL。

每個處理均為60 株嫁接苗，進行觀測和統計分析。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 強德勒柚實生苗生長指標的測定

發芽率采用直接計數法計算。根長和株高測定是將35 d 的幼苗整株從蛭石中取出，用清水洗凈根部基質，用直尺測量，測定10 個生物學重復。用天平分別稱量地上部分鮮質量和根鮮質量，測定5 個生物學重復，按文獻[13]計算根冠比。按文獻[14]測定葉面積，觀察8 個生物學重復。

1.4.2 強德勒柚實生苗葉綠素含量的測定

根據文獻[13]測定葉綠素的含量。從生長35 d 的植株上采樣，取新鮮葉片，去掉中脈，剪碎，稱取樣品0.5 g，分別放入研缽中，加12 mL 95%乙醇和少量石英砂，研成均漿至組織變白，靜置5 min。把提取液倒入漏斗中，過濾到25 mL 容量瓶中，用95%乙醇沖洗殘渣數次，并定容至25 mL，在波長665、649 nm 下分別測定吸光度A，分組準確記錄，每個處理測定3 個生物學重復。按照公式（1）（2）計算葉綠素a、b 的含量，根據式（3）進一步求出葉綠素的含量。

1.4.3 強德勒柚實生苗可溶性蛋白含量的測定

可溶性蛋白質的測定采用考馬斯亮藍G-250 法（Bradford 法）進行。

制作標準曲線：利用1 000 滋g/mL 的BSA 標準蛋白溶液，根據文獻[15]制作標準曲線。稱取新鮮柑橘葉片0.5 g/樣，加2 mL 蒸餾水研磨成勻漿，轉移到離心管中，再用6 mL 蒸餾水分次洗滌研缽，洗滌液收集于同一離心管中，在室溫下放置1 h 后過濾于10 mL 帶塞的試管中，定容至刻度，即得待測樣品提取液。每個處理重復3 次。

蛋白質含量的測定：先取10 mL 帶塞試管，分別吸取待測樣品0.1 mL，各加入5 mL 考馬斯亮藍G-250 試劑，在595 nm 波長下比色，并通過標準曲線計算樣品中可溶性蛋白質的含量[15]，每個處理設3 個重復。

1.4.4 蘆柑嫁接苗礦物元素的檢測方法

永春蘆柑嫁接苗的灰化提取方法是將葉片放入105 益的烘箱中殺酶30 min，再65 益烘干。將葉片磨碎成粉末，用坩堝精確稱取0.500 0 g 樣品，作好標記，將稱量好的樣品放進馬弗爐中，設置溫度為550 益，待馬弗爐的溫度升到550 益，灰化5 h，然后關閉馬弗爐，冷卻后取出樣品；將灰化好的樣品按次序擺好，用移液槍吸取10 mL的溶液（60%H2O+30%HCl+10%HNO3），放進坩堝，提取時間為30 min；將提取液倒進漏斗中過濾，將過濾好的溶液稀釋3 倍，然后用ICP-OES 電感耦合等離子體發射光譜儀進行檢測。

2 結果與分析

2.1 PGA 對柚實生苗生長的影響

經過35 d 的溫室培養，對PGA 處理后柚種子萌發和幼苗生長狀況進行觀察，結果表明：對照和處理的種子發芽率均為100%。孕鄖粵處理對柚苗生長的影響見表1，由表1 可知，50、100、200 mg/L 的PGA 處理柚種子后，其幼苗根長比對照分別提高3.1%、4.8%和9.7%，株高比對照分別提高了6.3%、2.2%和0.9%。PGA 濃度為100 mg/L時，根鮮質量顯著高于對照和200 mg/L PGA 處理的苗。PGA 濃度為100 mg/L 時，根冠比高于200 mg/L PGA 處理的。三種濃度PGA 處理的葉面積比對照的葉面積分別增大14.7%、20.6%和16.6%，差異均達到顯著水平。上述數據說明PGA 有促進實生苗營養生長的作用，為提高柑橘實生苗的光合作用效率奠定了基礎，其中100 mg/L PGA 處理效果較好。

2.2 PGA 對柚苗葉綠素和可溶性蛋白含量的影響

葉綠素是植物進行光合作用的主要色素和捕獲光的主要成分。高等植物葉綠體中的葉綠素主要有葉綠素a和葉綠素b 兩種。葉綠素a 和b 僅在吡咯環域上的附加基團上有差異：前者是甲基，后者是甲醛基。葉綠素a 最大吸收光的波長在420～663 nm，葉綠素b 的最大吸收波長范圍在460～645 nm。本試驗測定了葉綠素a 和葉綠素b 含量，結果見表2。由表2 可知，100、200 mg/L PGA 處理柚苗后，葉綠素a 含量均顯著高于50 mg/L PGA 處理和對照的。PGA 濃度為200 mg/L 時，葉綠素a含量達到最大，葉綠素遭含量沒有明顯變化。

表1 聚-谷氨酸處理對柚苗生長的影響Table 1 Effect on seedling growth by poly-glutamic acid treatment in pomelo

表1 聚-谷氨酸處理對柚苗生長的影響Table 1 Effect on seedling growth by poly-glutamic acid treatment in pomelo

注：不同小寫字母表示相互間差異顯著（）。

可溶性蛋白是重要的滲透調節物質和營養物質，它們的增加和積累能提高細胞的保水能力，對細胞的生命物質及生物膜起到保護作用，也經常用作篩選抗性的指標之一。實驗表明：可溶性蛋白的線性回歸方程為說明吸光度與可溶性蛋白濃度呈現良好的線性關系。由表2 可知，當100、200 mg/L PGA 處理苗木后，可溶性蛋白含量均極顯著地高于對照樣品。100 mg/L PGA 處理后，可溶性蛋白達到最高值。

表2 PGA 對葉綠素和可溶性蛋白含量影響Table 2 Effect of PGA on chlorophyll and soluble protein content(

表2 PGA 對葉綠素和可溶性蛋白含量影響Table 2 Effect of PGA on chlorophyll and soluble protein content(

注：不同小寫字母表示差異顯著，不同大寫字母表示差異極顯著（

2.3 PGA 對柑橘嫁接苗多項生長指標的影響

在第一組試驗中，A1 和B1 處理與對照相比，嫁接苗根數分別增加40.5%和8.1%，根長分別增加8.1%和23.3%，差異均不顯著（圖1A 和1B）。對植株高度進行比較，B1 處理與對照的差異達到顯著水平，A1 與B1 處理差異達到顯著水平（（圖1C）。對植株冠徑進行比較，可知A1 和B1 處理與對照的差異均達到顯著水平，A1 與B1 處理的差異不顯著（圖1閱）。對干徑進行比較，可知A1 和B1 處理與對照的差異均達到顯著水平，但A1 與B1 處理的差異不顯著，兩種濃度的PGA 都能顯著增加植株的粗度（圖1耘），使植株更為健壯。

在噴施PGA、KH2PO4和Urea 的第二組試驗中，A2和B2 處理后，與對照相比，根數分別增加17.3%和15.3%，根長分別增加17.3%和4.6%，A2、B2 和對照的差異均未達到顯著水平（圖1云和1鄖）。處理和對照的株高差異也未達到顯著水平（圖1勻）；冠徑比較，A2 和B2 處理與對照的差異均達到顯著水平（圖1隕）；對干徑進行比較，A2 和B2 處理與對照的差異均達到顯著水平，但A2 處理與B2 處理差異不顯著（圖1允），可見，不同濃度的PGA 與0.2%KH2PO4和0.2%Urea 配合均能增加樹干粗度，PGA 處理對嫁接苗地上部分的促進生長比地下部分更明顯。

2.4 PGA 對柑橘葉片中P、Na 和Zn 元素含量的影響

磷是植物必需的大量元素之一，在生物遺傳信息和能量傳遞中起極其重要的作用。鈉是植物生長所必需的營養元素，植物缺鈉后會出現黃化病。鋅在植物體內主要是作為酶的金屬活化劑。本研究對永春蘆柑苗木中的大量和微量元素進行了分析，如表所示。

表3 PGA 處理柑橘嫁接苗后葉片中大量和微量元素含量（mg/L）Table 3 Macroelements and microelements contents in leaves after PGA treatment(mg/L)

3 討論

試驗證明PGA 能提高柚實生苗根的鮮質量和葉面積，可增加葉片的葉綠素a 和可溶性蛋白含量，有助于嫁接苗株高、冠徑和干徑的增加。在光合作用中，絕大部分葉綠素的作用是吸收及傳遞光能，僅極少數葉綠素a 分子起轉換光能的作用，它們在活體中是與蛋白質結合在一起，存在于類囊體膜上。提高葉綠素a 含量有利于提高光合作用效率[16]。可溶性蛋白是重要的滲透調節物質和營養物質，它們的增加和積累能提高細胞的保水能力，對細胞的生命物質及生物膜起到保護作用，經常用作篩選抗性的指標之一。可溶蛋白質含量的提高，還會增加細胞滲透濃度和功能蛋白的數量，有助于維持細胞正常代謝[17]。可見PGA 能加強光合作用和促進生長指標的改善，提高細胞的代謝功能。

PGA 還可提高磷元素的利用率。磷是礦質元素，吸收動力靠蒸騰作用，它又是一種無機鹽，無機鹽需要與水一起進入植物的體內，植物是靠根尖成熟區吸收的。當植物體外的無機鹽濃度大于植物成熟區細胞的細胞液濃度時，植物體就會從外界吸收無機鹽。細胞膜的主動運輸需要消耗ATP，主動運輸是逆濃度階梯運輸的，由于磷離子較大，要靠細胞膜上蛋白質消耗能量來運輸[18]。植物磷營養高效利用通常與根形態、根分泌物、膜與體內磷轉運以及菌根等因素有關，表現為受多基因控制。

本試驗證明PGA 處理柑橘，能促進實生苗和嫁接苗的根系生長，增加根的數量，這意味著根尖成熟區吸收磷的機會增加。PGA 可以提高磷元素利用率的另一個可能原因是PGA 通過與形成穩定的絡合物，從而起到磷肥緩釋劑的作用。植物對一些離子的吸收和利用與離子結合常數的大小有關。前人研究報道，PGA 與的結合常數，PGA 與Na+的結合常數由于PGA與離子產生絡合作用，可以通過緩效釋放過程提高柑橘對P 和Na 的吸收。

大量苗木實地試驗證明，PGA 處理對柑橘苗木營養生長的促進作用非常明顯。PGA 灌根處理能顯著增加株高、冠徑和干徑。PGA 與KH2PO4、Urea 組合葉面噴施，能提高冠徑和干徑，PGA 對苗木根系根數和根長有一定的促進作用，但其效果還沒有達到顯著水平。通過上述兩組試驗可知，PGA 處理后的苗木葉片增厚，葉色深綠，苗木強壯，這就為苗木后續的生殖生長奠定了基礎。PGA 是綠色安全、環保的多肽化合物，能顯著提高柑橘嫁接苗的質量。如果這項技術能夠廣泛地推廣和應用，對于提高柑橘苗木質量、發展無病毒良種繁育有非常重要的意義。

然而PGA 在柑橘上使用時，可能含有少量的活菌存在，但主要的作用還在于多肽分子化合物。即使有活菌，即地衣芽孢桿菌的存在，也是起益生菌的作用。但本試驗過程中，我們認為起主要作用的還是PGA。PGA 與其它菌肥相比，有其優勢。益生菌的作用機制主要包括拮抗作用、競爭作用、重寄生作用、誘導植物抗性、促進植物生長等，益生菌在田間條件下可能是多種機制共同作用，也可能在植株不同發育時期、不同部位某一機制在起作用，以達到抑制病原的生長、繁殖或殺滅病原的效果。拮抗作用指一種微生物在其生命活動過程中產生的次生代謝物質對其他微生物的活性產生抑制甚至殺滅作用。競爭作用指兩種或多種微生物爭奪生存空間、位點、營養、水分等，益生菌能在植物體內成為優勢菌種，從而限制其它致病菌的生長。植物抗性的產生有兩種誘導途徑：一是系統獲得性抗性（Systemic acquired resistance，SAR），病原物侵染后，未接種部位誘導出對病原物的抗性；二是誘導系統抗性（Induced systemic resistance，ISR），非病原物刺激植物后，使植物體產生物理或化學屏障，從而增強抗性。益生菌也可通過促進植物生長的作用，從而提高植株抗病性。因此，今后可以對PGA 的作用機制作更深入的探索，從而為PGA 在植物上的應用奠定更堅實的基礎。