肝細胞癌組織離體后室溫放置時間與RNA 穩定性及堿基質量的關系

何璟榮 李近都 黃浩 莫以帥 廖迎陽 朱少亮 彭寧福（通訊作者）

（廣西醫科大學附屬腫瘤醫院 廣西 南寧 530021）

轉錄組高通量測序實驗必須用未發生核糖核酸（Ribonucleic Acid，簡稱RNA）降解的組織標本，才能保障實驗數據的保真性[1]，肝組織內RNA 降解酶含量較其它組織豐富[2]，因此肝癌標本體外留置的保鮮期備受關注。本研究對不同體外留置時間的肝癌標本分別建立基因文庫，觀察RNA 的穩定性及其測序質量。

1.資料與方法

1.1 標本來源、采集、分組、RNA 提取和質量檢測

本研究經廣西醫科大腫瘤醫院倫理委員會審理符合倫理規范，并取得知情同意后，隨機選取5 例（男3、女2）肝細胞癌患者在廣西醫科大學附屬腫瘤醫院行根治性部分肝切除術后的肝癌組織標本，25℃室溫體外留置。按體外留置時間分為10、20、30、40 和50min，共5 組。采用MQ-Gene1000-96 通量全自動核酸提取儀，配套石蠟包埋組織基因組RNA 提取試劑盒提取RNA；UV-1900 紫外分光光度計和安捷倫UniCel DxI800 全自動免疫分析儀行穩定性質量檢測；Tru Seq Small RNA Sample Prep Kits 構建文庫；Ion Torrent 基因組測序儀、Fast QC software檢測測序數據質量。

1.2 RNA 質量評價方法

參照文獻[3-4]綜合評價。（1）雜質比率：A260、A280 和A230 分別代表核酸、蛋白質和有機溶劑的含量。A260/A230 比值評估RNA 標本有機溶劑殘留，比值≥1.5 為RNA 雜質比合格。A260A/280 比值評估RNA 標本蛋白質污染，比值在1.8 ～2.1 之間為合格。（2）穩定性比率：5S、18S 和28S 分別代表120、1900 和4700 個核苷酸的核糖體（rRNA）含量，28s/18s 比值在1.8 ～2.0 間為RNA 穩定比合格。（3）完整性指數（RIN：RNA Integrity Number）：綜合計算總RNA 比例18S 和28S 曲線下總面積率、28S 峰度、5S 和18S 曲線下總面積率和標記峰的高度4個參數，RIN ≥6 為RNA 完整度合格。（4）堿基質量：將短序列的每個堿基標注其準確度的值（Q 值），Q ＜20 為堿基正確率達99%，錯誤率為1.0%，Q ≥20 為堿基質量合格。（5）CG 含量：要求樣本序列CG 含量的分布與理論含量的分布一致性相關≤15%，亦可用CG 含量≥48%評價CG 含量合格。（6）短序列匹配率：RNA 質量與短序列匹配率相關。在同一批實驗中，匹配率和單一匹配率明顯低的標本，判定為RNA 質量不合格。

1.3 統計學方法

應用SPSS21.0 軟件進行統計分析，計量資料采用均數和標準差（±s）表示，多組資料比較用F 檢驗，兩兩比較用Q 檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 肝癌標本體外不同留置時間與RNA 純度、穩定性及完整性的比較

體外留置50 min 組的A260/A280 比值不如留置≤40min 組（P＜0.01），提示放置時間在50min 內各組標本提取RNA 的蛋白質雜質含量純度仍符合最低要求。留置≥40min 組其A260/A230、28S/18S 和RIN 均不如留置≤30min 組（P＜0.01），提示標本放置時間在30min 內，其RNA 的酚類化合物比例和大、小分子RNA 的比例與完整性仍然符合最低要求，放置時間≥40min的標本，其酚類化合物比例、大、小分子RNA 比例及RNA 完整性未達到最低要求（見表1、圖1）。

表1 肝癌標本體外不同留置時間與RNA 純度、穩定性及完整性比較（±s，N=5）

表1 肝癌標本體外不同留置時間與RNA 純度、穩定性及完整性比較（±s，N=5）

留置時間 A260/A280 A260/A230 rRNA（28S/18S） RIN 10 min 2.23±0.08 2.09±0.18 1.95±0.13 9.014 20 min 2.17±0.04 2.20±0.08 1.88±0.09 9.224 30 min 2.12±0.09 1.97±0.06 1.92±0.12 8.454 40 min 1.91±0.07 1.91±0.04 1.67±0.01 7.086 50 min 1.58±0.56 1.72±0.07 1.39±0.10 6.332 10 比20（q,P） 0.058,0.726 0.110,0.092 0.074,0.245 0.210，0.562 10 比30（q,P） 0.110,0.508 0.120,0.068 0.028,0.656 0.560，0.131 10 比40（q,P） 0.320,0.064 0.186,0.007 0.282,0.000 1.928，0.000 10 比50（q,P） 0.656,0.001 0.374,0.000 0.556,0.000 2.682，0.000

圖1 肝癌標本不同放置時間RNA 純度穩定性及完整性的檢測峰圖與電泳膠圖變化情況

2.2 肝癌標本體外不同留置時間與堿基質量、CG 含量及短序列匹配率比較

體外留置50min 組的堿基質量不如留置≤40min 組（P＜0.05），提示標本RNA 的穩定性質量符合最低要求。留置≥40min 組的堿基CG 含量、短序列匹配率和單一短序列匹配率不如留置≤30min 組（P＜0.01），提示留置≥40min 組RNA 穩定性未達到最低要求（見表2，圖2）。

表2 肝細胞癌標本不同放置時間與堿基質量、CG 含量及映射讀序率的關系（±s，,N=5）

表2 肝細胞癌標本不同放置時間與堿基質量、CG 含量及映射讀序率的關系（±s，,N=5）

放置時間 %≥Q20 CG 含量（%） 映射率（%） 單獨映射率（%）10 min 99.96±0.02 49.67±0.58 87.20±0.12 85.55±0.04 20 min 99.96±0.02 50.33±0.44 88.36±0.14 83.19±0.03 30 min 99.97±0.02 49.67±1.16 87.75±0.12 81.81±0.01 40 min 99.95±0.01 46.67±0.56 71.58±0.16 75.80±0.02 50 min 99.93±0.01 44.67±1.53 63.39±0.23 68.08±0.15 10 比20（q,P） 0.006，0.578 0.667，0.418 0.012，0.292 0.034，0.262 10 比30（q,P） 0.014，0.202 0.136，0.863 0.006，0.605 0.037，0.089 10 比40（q,P） 0.100，0.358 3.135，0.000 0.156，0.000 0.097，0.001 10 比50（q,P） 0.026，0.024 5.068，0.000 0.238，0.000 0.175，0.000

圖2 肝癌標本不同放置時間測序讀序堿基Q 值變化情況

3.討論

轉錄組學對RNA 樣本的穩定要求比較高，因此嚴格處置標本，對保障RNA 樣本質量在轉錄組學研究中具有重要意義。RNA穩定性包括純度與完整性兩方面。RNA 純度與提取RNA 的試劑、方法及樣品稀釋度有關。RNA 完整性與其降解相關，樣品一旦發生RNA 降解，其相繼的實驗研究結果將出現系統性偏差。研究表明標本離體后，其RNA 穩定性的影響因素較多，如標本儲存環境、細胞裂解、RNA 分離方法、內源核糖核酸酶（RNase）激活、環境RNase 污染、低濃度RNA 的沉淀、提取后的RNA 儲存、源自富含降解酶的器官樣品等均可影響RNA 穩定性[5]。目前，多數采用核糖體（rRNA）28S 及18S 的吸收峰值來評價RNA 完整性，通常認為一旦降解酶發生作用，每個基因降解水平均相同，參考基因在完整及降解樣品中的穩定性則有差別；同時，28S 和18S 條帶比率具有一定的組織及細胞特異性。因此，基因表達差異的探索中,應將樣品與同標本來源的完整對照樣品比較,盡量避免完整樣品與降解樣品的相互比較[6]。本研究表明，肝癌組織標本離體后，在25℃環境下放置30min內處置，提取RNA的穩定性尚有質量保障；離體40min 后處置，其RNA 已有一定降解。因此，對于轉錄組研究所采用的肝癌標本，為保障標本RNA 純度及完整性、保障后續研究質量，應在離體后30min 內用快速凍存等方法處置。