熱缺血損傷豬肝臟在門靜脈恒壓和恒流模式下常溫機械灌注的對比研究

何錫然 譚曉宇 張琳 鄺偉鍵 劉華敏 陳素平 郭家钘 梁銘炬 周偉津 霍楓

肝移植已經成為終末期肝臟疾病的主要治療手段[1-2]。伴隨肝移植手術例數的激增，供肝相對短缺的問題日益突出。因此，移植中心已經越來越多地轉向于使用擴展標準供體和心死亡供體(donation after circulatory death，DCD)的器官。目前，中國42.98%的器官供體屬于DCD[3]。但是傳統的靜態冷保存并不能有效保存DCD肝臟，而且長時間的冷保存會增加缺血再灌注損傷、移植物早期功能障礙、原發性無功和缺血性膽管病的發生風險，導致移植失敗和患者死亡[4-5]。

體外常溫機械灌注(normothermic machine perfusion，NMP)作為一種新的保存技術，近幾年已進入臨床試驗階段[6-8]。但是，該技術操作難度較大，且缺乏統一的實施標準，包括灌注溫度、灌注液配方及灌注控制的模式等[9]。目前，NMP模式主要為壓力控制[10]。在壓力模式下，由于門靜脈的壓力較低，一旦壓力測量出現偏差，會對流量造成較大的影響，過低的流量會導致肝臟營養供應不足，過高的流量會導致肝竇過度擴張，從而導致剪應力，破壞內皮細胞線性，進而會干擾實質細胞的保存效果，提示門靜脈恒流模式可能更有利于肝臟灌注。因此，本實驗對比門靜脈恒壓和恒流模式下對熱缺血60 min肝臟常溫灌注的效果，初步探索兩種模式在供肝保存上的差異。

資料與方法

一、實驗動物

健康巴馬小型豬12只，雌性，體質量45～50 kg，由解放軍南部戰區總醫院(陸總)動物實驗中心提供。每頭實驗豬既用作血液的供體，又用作肝臟的供體。實驗操作過程符合動物實驗的倫理要求。

二、實驗方法

(一)灌注設備 由廣東順德工業設計研究院(廣東順德創新設計研究院)、中國人民解放軍南部戰區總醫院、廣東丁沃生醫療器械有限公司聯合研發的常溫機械灌注設備(DEVOCEAN-LIVER 2000)可以對離體肝臟進行肝動脈和門靜脈雙重灌注，主要構建部件如下：2個離心泵；2個氧合器；溫度傳感器；2個壓力傳感器；2個流量傳感器；2個濾血栓；溫控水箱；自制的儲肝器、自制的灌注管路以及自制門靜脈、肝動脈、膽管插管等。

(二)豬血液及肝臟獲取 在誘導麻醉后，豬耳緣靜脈留置套管針建立輸液通道，利用微量注射泵以每小時2～5 mg/kg的劑量泵入丙泊酚維持麻醉。氣管插管，連接呼吸機。腹部正中線切口進腹，游離腹主動脈、下腔靜脈及門靜脈。于腹主動脈和下腔靜脈置入已剪開口的16-Fr導尿管取血，血液過濾去除白細胞。靜置實驗豬60 min。熱缺血60 min后，結扎胸主動脈，于腹主動脈和門靜脈置入插管，進行在體冷灌注。快速取下肝臟，修整肝門區多余組織，剔除肝門區域的淋巴結，進行肝動脈和膽道插管，記錄肝臟重量。

(三)常溫機械灌注液和常溫機械灌注參數設定 灌注液由豬全血1500 mL，150 mL羥乙基淀粉130/0.4電解質注射液，800 U肝素鈉注射液，1 g注射用頭孢西丁鈉組成。灌注之前灌注管路內用150 mL羥乙基淀粉130/0.4電解質注射液混合部分全血進行預充，排除管路中的氣泡。肝臟連接儀器，門靜脈恒壓組(n=6)，門靜脈壓力設定為6～8 mmHg，門靜脈恒流組(n=6)，門靜脈流量設定為0.5 mL/min/g。兩組肝動脈均采用恒壓脈沖式灌注，灌注壓力為60/80 mmHg，灌注6 h，灌注溫度為37℃。記錄冷缺血時間(從在體冷灌注至肝臟上機所需的時間)。

(四)觀察指標 灌注過程中每2小時取灌注液，離心后留血漿進行血氣及生化檢測，分析酸堿度、血糖、乳酸、尿素氮、TBil、ALT、乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶、γ-谷氨酰轉肽酶等指標變化趨勢。記錄灌注過程中每小時產生的膽汁量。灌注過程中，每2小時取肝組織留作組織病理學檢查，根據鈴木評分以及其他文獻介紹的辦法，從淤血、空泡化、壞死、水腫以及肝竇擴張等方面進行評分，每個方面分為無、輕度、中度和重度，分別評分0、1、2、3，每張切片隨機選取3個視野進行雙人評分，最后統計每項得分以及總得分[11-13]。

三、統計學方法

采用SPSS 23.0統計學軟件進行數據處理。正態分布的計量資料以(均數±標準誤)表示，比較采用t檢驗，若方差不等，則采用近似t檢驗，若樣本不服從正態分布則采用非參數檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、灌注前兩組肝臟的對比

灌注前，門靜脈恒壓組的冷缺血時間為(100.50±24.32)min，門靜脈恒流組的冷缺血時間為(83.50±26.51)min，(P>0.05)，表明兩組肝臟灌注前的缺氧情況無差異，兩組可比。

二、灌注過程的血流動力學參數

兩組肝動脈均采用恒壓灌注模式，門靜脈恒壓組的平均肝動脈流量為(0.13±0.08)mL/(min·g)(肝重)，而門靜脈恒流組的肝動脈流量為(0.25±0.09) mL/(min·g)(肝重)，其中灌注5 h和6 h兩個時間點兩組的肝動脈流量差異有統計學意義(P<0.05)(圖1)。門靜脈恒壓組的平均門靜脈流量為(0.78±0.19)mL/(min·g)，而恒流組的則為(0.54±0.07)mL/(min·g)，門靜脈恒壓組的平均門靜脈壓力為(7.59±0.17)mmHg，而恒流組的則為(5.16±0.84)mmHg，由于兩組門靜脈控制模式不同，未對門靜脈流量和壓力進行比較。

圖1 離體豬肝常溫機械灌注過程中肝動脈流量

三、灌注過程兩組血氣生化指標以及膽汁生成量對比

在灌注過程中，兩組的pH值均穩定維持在生理值水平附近，差異無統計學意義(P>0.05)。乳酸水平在恒流組中較低，但兩組在灌注過程的比較差異無統計學意義(P>0.05)。兩組的血糖水平均呈先升高后下降的趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。而兩組的BUN在灌注過程中逐步升高，說明兩組肝臟能夠進行正常的蛋白質代謝，除了灌注初期的第2小時，兩組灌注后期的BUN水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。在灌注過程中，兩組的TBil 變化平穩，未出現明顯上升，組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。兩組在灌注結束時(6 h)肝細胞酶學差異無統計學意義(P>0.05)，提示兩組肝細胞受損水平相當。恒壓組6 h積累膽汁生成量為(6.98±3.20) mL，恒流組6 h積累膽汁生成量為(54.47±15.63) mL，兩組的每小時膽汁累積生成量差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 離體豬肝常溫機械灌注過程中灌注參數和代謝指標

四、灌注過程兩組病理學的改變

灌注結束時，兩組的鈴木評分差異無統計學意義(P>0.05)，但是恒流灌注組呈較有規律的下降趨勢。從淤血、空泡化、壞死、水腫以及肝竇擴張等單項評分觀察，雖然恒流灌注組在灌注結束時的平均值低于恒壓組，但是差異無統計學意義(P>0.05)。病理改變見圖3。

圖3 離體豬肝常溫機械灌注過程中的病理切片(×200) a-b. 豬肝臟門靜脈恒壓組NMP 0 h和6 h肝組織；c-d. 豬肝臟門靜脈恒流組NMP 0 h和6 h肝組織

討 論

目前國外的研究結果提示NMP比傳統靜態冷保存具有以下優勢：①延長器官保存時間，②改善肝臟功能，③體外檢測肝臟活力，④具有通過添加藥物來修復受損肝臟的潛力，⑤完善肝移植的手術時間安排[4, 5, 14-16]。

本實驗對NMP的門靜脈灌注模式進行了初步的探索，對比了壓力恒定和流量恒定兩種模式對DCD肝臟常溫灌注的影響。在冷缺血時間可比的前提下，兩組灌注過程的血氣和生化指標變化差異無統計學意義，說明相比主流的壓力控制模式，流量控制模式未使肝臟出現明顯的異常情況，而且各種指標變化均比較平穩，提示流量控制模式并不劣于壓力控制模式的替代模式。在膽汁生成方面，流量控制模式似乎顯露出其優勢。在本研究中，門靜脈恒流組的膽汁生成量比恒壓組高，提示維持門靜脈穩定的灌注可能更有利于肝細胞進行膽汁的合成。門靜脈對血流的自身調節能力有限，而肝動脈則具有較強的血流自身調節能力。門靜脈血流變化會引起肝動脈血流出現相應變化，即肝動脈緩沖效應，大量研究發現，小體積供肝移植術后早期，門靜脈高灌注可引起肝動脈血流顯著下降，從而導致膽道缺血、小葉微小血管脂肪變，最終導致移植肝細胞和膽管細胞壞死，再次減少有效肝體積[17]。控制門靜脈流量更有利于維持肝動脈的流量，

從而更利于肝細胞以及膽管的供氧，進而更利于肝臟進行正常代謝。

在病理學方面，流量恒定模式的淤血、空泡化、壞死、水腫以及肝竇擴張的評分與壓力恒定模式相當。Vekemans等[18]利用豬動物模型和低溫機械灌注探索了流量對肝臟的影響，結果發現高流量組在灌注4 h后出現空泡，低門靜脈流量聯合氧氣組在12 h后肝竇仍保持完整，空泡數量較少。而且低門靜脈流量聯合氧氣組更有利于維持ATP水平。在組織病理學方面，高流量組灌注引起了更嚴重的肝竇擴張。說明低門靜脈流量聯合氧氣組不僅有助于改善肝組織缺氧情況，而且能夠在適當打開微循環的情況下維持肝實質的完整性。Hart等[19]利用鼠肝臟探索了低溫灌注下最合適的壓力，結果表明25%的壓力可以達到100%的灌注，而且灌注24 h后，與50%的相比，25%的灌注壓力導致的死細胞數量更少，以上結果表明較低的灌注壓力不僅能夠維持肝臟的有效灌注，而且能夠減少內皮細胞的損傷，提示肝臟的離體灌注需要避免過量灌注。

綜上所述，本實驗對比了門靜脈恒壓灌注和恒流灌注在DCD肝臟上的灌注效果，結果表明流量控制模式并不劣于主流的壓力控制模式，血氣和生化指標穩定，而且流量控制模式可能更有利于肝臟的供血，從而促進肝細胞進行膽汁合成。由于目前尚無統一評價體外灌注肝臟質量的標準，因此項目組未來將開展動物肝移植實驗以及臨床肝移植試驗，以進一步驗證以上假設。