發(fā)酵蟲草菌粉對慢性疲勞大鼠行為及ACTH、CORT的影響

郭智寬 田 捧

慢性疲勞綜合征(chronic fatigue syndrome，CFS)是一組臨床表現(xiàn)為持續(xù)時間大于6個月的體力、腦力疲勞，同時伴有肌肉痛、關節(jié)痛、頭痛及情緒低落、失眠、抑郁等心理精神癥狀的綜合征[1]。在古代中醫(yī)藥著作中尚未發(fā)現(xiàn)慢性疲勞綜合征的病名，根據(jù)CFS的臨床表現(xiàn)，其應屬于“虛勞”“郁證”“內傷發(fā)熱”等范疇。多數(shù)中醫(yī)學者認為其病位以肝、脾、腎為主，發(fā)病多因思慮、勞作過度或外邪侵襲致肝、脾、腎受損致使肝失疏泄，脾失運化，腎氣不充而導致氣血陰陽虧虛，從而引發(fā)本病。冬蟲夏草性溫味甘；歸腎、肺經(jīng)；具有補腎益肺，止血化痰的功效。發(fā)酵蟲草菌粉膠囊系從青海冬蟲夏草中分離所得的蟲草擬青霉CS-4菌株，經(jīng)純化、人工發(fā)酵培養(yǎng)加工制成的口服制劑。與天然蟲草有著類似的化學成分和藥理作用。我們前期臨床觀察中發(fā)現(xiàn)發(fā)酵蟲草菌粉膠囊對CFS患者有比較好的療效[2]。但其對CFS治療的作用機理尚不明確，鑒于此，我們在以往的研究基礎上，用慢性疲勞大鼠動物模型來觀察發(fā)酵蟲草菌粉膠囊對CFS的治療作用，從而探討其作用機理。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物SPF級成年雄性SD健康大鼠72只，體質量(200±20)g,由河南省實驗動物中心提供(許可證號：SCXK豫2005-0001)。

1.1.2 動物飼料大鼠標準飼料，由河南省實驗動物中心提供(許可證號：SCXK豫2005-0001)。

1.1.3 實驗藥品發(fā)酵蟲草菌粉(金水寶)膠囊由江西濟民可信藥業(yè)有限公司制造，國藥準字Z10890003，規(guī)格：0.33 g/粒；蓯蓉益腎顆粒由內蒙古蘭太藥業(yè)有限責任公司制造，國藥準字Z20030099，規(guī)格:2 g/袋。

1.1.4 實驗試劑及儀器促腎上腺皮質激素放射免疫分析試劑盒購自北京北方生物技術研究所；碘[125I]皮質醇放射免疫分析藥盒購自北京北方生物技術研究所；Morris水迷宮(中國醫(yī)學科學院藥物研究所生產)；SN-682型放射免疫γ計數(shù)器(上海核福光電儀器有限公司生產)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組正常喂養(yǎng)1周，72只大鼠自然飲食，在室內光照，溫度(20±1)℃，相對濕度40%的環(huán)境中，6只/籠，適應性飼養(yǎng)1 周后將SD大鼠72只采用統(tǒng)計軟件進行隨機分組，分為正常組、模型組、發(fā)酵蟲草菌粉高、中、低劑量組、蓯蓉益腎顆粒組，每組12只。

1.2.2 造模方法造模之日起，除正常組外，其余大鼠根據(jù)文獻報道[3,4]的睡眠剝奪+負重力竭游泳方法建立復合因素致慢性疲勞大鼠模型。睡眠剝奪方法：向鼠籠內注入1.5 cm深的水，將大鼠放入其中盒蓋上放置飼料和水，使大鼠能夠自由進食飲水。每日于13:00將大鼠放入，次日9:00將大鼠取出，睡眠剝奪共20 h；負重力竭游泳方法：睡眠剝奪后，每日9:00進行負重力竭游泳訓練，將負重其身體質量的5%的大鼠放入水深50 cm的游泳池內，水溫(25±1)℃，使其游泳至力竭，頭部沒入水中10 s無法浮出水面即判定為力竭狀態(tài)。

1.2.3 大鼠學習記憶能力及游泳速度測試方法采用Morris水迷宮(Morris water maze, MWM)，規(guī)格：直徑150 cm，高60 cm，內設一低于水面的圓柱形平臺直徑9 cm，水深以高過平臺2 cm為度，造模前2 d將大鼠按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限順序依次放入水迷宮實施訓練，造模前1天進行水迷宮測試，將大鼠從2個固定點入水到找到平臺所需的平均時間，作為大鼠學習成績。造模結束后第1天再次測試各組大鼠水迷宮實驗找到平臺所需的時間，作為大鼠的記憶成績。在測時間的同時檢測大鼠游泳速度。

1.2.4 鼠尾懸掛實驗將大鼠尾端2 cm的部位粘貼在一水平板上(使板離地1 m)，使動物呈倒掛狀，計算6 min內的不動時間。造模前1 d和造模結束后1 d分別測試1次。

1.2.5 給藥方法從造模第14天開始，正常組正常飼養(yǎng)，模型組給予生理鹽水灌胃，3 ml/只；蓯蓉益腎顆粒組按417 mg·kg-1·d-1給予蓯蓉益腎顆粒灌胃，3 ml/只；發(fā)酵蟲草菌粉組高、中、低劑量組分別按1238 mg·kg-1·d-1，619 mg·kg-1·d-1，309 mg·kg-1·d-1(藥物劑量按等效劑量的直接折算法計算，309 mg·kg-1·d-1相當于人臨床劑量的等效量)給予發(fā)酵蟲草菌粉混懸液灌胃，3 ml/只。各組大鼠給藥均1次/d，連續(xù)14 d。

1.2.6 標本制作方法

1.2.6.1 檢測ACTH標本的采集及檢測實驗結束后，用10%水合氯醛腹腔注射(0.3 ml/100 g)麻醉大鼠后，打開腹腔，從腹主動脈取血2 m1收集到加有10%EDTA-2Na30 μl和抑肽酶20 μl的試管中，混勻于離心機4 ℃、3000 rpm離心10 min，分離血漿放置冰箱冷凍(-20 ℃)中保存待測ACTH。冰凍樣品測定前，使樣本置于室溫中復融，再次4 ℃、3000 rpm離心5 min,取上清測定。檢測時按照試劑盒說明書方法進行檢測。

1.2.6.2 檢測CORT標本的采集采血方法同上。檢測時按照試劑盒說明書方法進行檢測。

2 結果

2.1 鼠尾懸掛實驗造模前各組大鼠6 min間斷不動時間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；造模后，與正常組比較，模型組大鼠6 min不動時間明顯延長，差異有極顯著性意義(P<0.01)；與模型組比較，發(fā)酵蟲草菌粉高、中、低劑量組及蓯蓉益腎顆粒組6 min不動時間縮短，差異有極顯著性意義(P<0.01)；與蓯蓉益腎顆粒組比較，發(fā)酵蟲草菌粉高劑量組6 min不動時間縮短，差異有極顯著性意義(P<0.01)，發(fā)酵蟲草菌粉中劑量組6 min不動時間縮短，差異有顯著性意義(P<0.05)，發(fā)酵蟲草菌粉低劑量組6 min不動時間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；與發(fā)酵蟲草菌粉低劑量組比較，發(fā)酵蟲草菌粉中劑量組6 min不動時間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，發(fā)酵蟲草菌粉高劑量組6 min不動時間縮短，差異有極顯著性意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠造模前后鼠尾懸掛間斷不動時間比較 (只，

2.2 morris水迷宮實驗造模前各組大鼠學習成績無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；造模后，與正常組比較，模型組大鼠找到水中平臺時間延長，記憶成績下降，差異有極顯著性意義(P<0.01)；與模型組比較，發(fā)酵蟲草菌粉高、中、低劑量組及蓯蓉益腎顆粒組記憶成績提高，差異有極顯著性意義(P<0.01)；與蓯蓉益腎顆粒組比較，發(fā)酵蟲草菌粉高、中劑量組記憶成績提高，差異有極顯著性意義(P<0.01)，發(fā)酵蟲草菌粉低劑量組記憶成績提高，差異有顯著性意義(P<0.05)；與發(fā)酵蟲草菌粉低劑量組比較，發(fā)酵蟲草菌粉高劑量組記憶成績提高，差異有極顯著性意義(P<0.01)，發(fā)酵蟲草菌粉中劑量組無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表2。造模前，各組游泳速度無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；造模后，與正常組比較，模型組大鼠游泳速度減慢，差異有極顯著意義(P<0.01)；與模型組比較，發(fā)酵蟲草菌粉高、中、低劑量組及蓯蓉益腎顆粒組游泳均速度增快，差異有極顯著意義(P<0.01)；與蓯蓉益腎顆粒組比較，發(fā)酵蟲草菌粉高、低劑量組速度較快，差異有顯著意義(P<0.05)；發(fā)酵蟲草菌粉高、中、低劑量組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表2 各組大鼠造模前后學習、記憶成績比較 (只，

表3 各組大鼠造模前后游泳速度比較 (只，

2.3 血漿ACTH含量與正常組比較，模型組大鼠血清ACTH含量明顯升高，差異有極顯著性意義(P<0.01)；與模型組比較，發(fā)酵蟲草菌粉高、中、低劑量組及蓯蓉益腎顆粒組ACTH含量降低，差異有極顯著性意義(P<0.01)；與蓯蓉益腎顆粒組比較，發(fā)酵蟲草菌粉高、中劑量組含量進一步降低，差異有極顯著性意義(P<0.01)，發(fā)酵蟲草菌粉低劑量組ACTH含量無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；與發(fā)酵蟲草菌粉低劑量組比較，發(fā)酵蟲草菌粉高劑量組ACTH含量降低明顯，差異有極顯著性意義(P<0.01)，而與發(fā)酵蟲草菌粉中劑量組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠造模后血漿ACTH含量比較 (只，

2.4 血清CORT含量造模后，與正常組比較，模型組大鼠血漿CORT含量明顯升高，差異有極顯著性意義(P<0.01)；與模型組比較，發(fā)酵蟲草菌粉高、中、低劑量組及蓯蓉益腎顆粒組CORT含量降低，差異有極顯著性意義(P<0.01)；與蓯蓉益腎顆粒組比較，發(fā)酵蟲草菌粉高劑量組CORT含量降低明顯，差異有極顯著性意義(P<0.01)，發(fā)酵蟲草菌粉中劑量組差異有顯著性意義(P<0.05)，發(fā)酵蟲草菌粉低劑量組與其相比CORT含量無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；與發(fā)酵蟲草菌粉低劑量組比較，發(fā)酵蟲草菌粉高劑量組CORT含量降低明顯，差異有極顯著性意義(P<0.01)，而與發(fā)酵蟲草菌粉中劑量組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表5。

表5 各組大鼠造模后血清CORT含量比較 (只，

3 討論

CFS是一種可發(fā)生于成人、青少年、兒童各個年齡階段的以長期身心疲勞為主要表現(xiàn)的疾病[5]。隨著現(xiàn)代人們競爭壓力逐漸加大，CFS的發(fā)病率呈逐漸升高趨勢，國外報道成人患病率在0.23%～2.60%[6]，中學生中患病率在0.1%～2%[7]。目前其病因并不明確，其中很多研究認為長期的精神壓力、體力超負荷等多重應激導致下丘腦-垂體-腎上腺素軸異常是其發(fā)生的關鍵原因之一[8]。而我國沈自尹院士認為中醫(yī)腎虛本質為下丘腦-垂體-腎上腺素軸功能紊亂[9]。《素問·六節(jié)藏象論》曰：“腎者，作強之官，伎巧出焉。”《靈樞·海論》中說：“髓海不足，則腦轉耳鳴，脛酸眩冒，目無所見，懈怠安臥”。因此腎虛可以導致腦力、體力疲勞的產生。結合以上理論，我們認為中醫(yī)治療CFS應以補腎為主。發(fā)酵蟲草菌粉是從冬蟲夏草中分離所得的蟲草擬青霉CS-4菌株，經(jīng)純化、人工發(fā)酵培養(yǎng)加工制成的口服制劑，與天然蟲草有著類似的化學成分和藥理作用[10]。其可補益肺腎，秘精益氣，能夠上補肺臟，下補腎臟。明·汪綺石《理虛元鑒》中說：“治虛有三本，肺脾腎是也。”發(fā)酵蟲草菌粉可用于肺腎兩虛導致的精氣不足，神疲乏力，不寐健忘，腰膝酸軟，月經(jīng)不調，陽痿早泄等癥，不但與CFS癥狀相符合，也符合治虛治則。

本研究顯示：①中藥發(fā)酵蟲草菌粉膠囊能夠縮短慢性疲勞大鼠的懸掛不動時間、記憶成績等疲勞指標，降低慢性疲勞狀態(tài)下血漿ACTH、CORT水平且隨劑量的增大而效果明顯。②對抗慢性疲勞狀態(tài)下ACTH、CORT的增加，抑制HPA軸的功能亢進可能是發(fā)酵蟲草菌粉治療CFS有效的機制之一。