固相萃取-氣相色譜質譜測定牛奶中氯氟氰菊酯和氯氰菊酯殘留

張 群，吳南村，馬 晨，張 月，劉春華

(1.中國熱帶農業科學院分析測試中心，海南 海口 571101 ； 2.海南省熱帶果蔬產品質量安全重點實驗室，海南 海口 571101)

一直以來人們極為重視牛奶中獸藥、抗生素殘留，但我國對牛奶中農藥殘留的關注不夠。我國未制定牛奶中氯氟氰菊酯和氯氰菊酯的最大殘留限量[1]，歐盟和國際食品法典委員會(CAC)規定了牛奶中氯氟氰菊酯的最大殘留限量分別為0.02 mg/kg[2]和0.2 mg/kg[3]； 歐盟和CAC均規定了牛奶中氯氰菊酯的最大殘留限量為0.05 mg/kg[4-5]。有報道指出,牛奶中檢出氯氟氰菊酯(0.11～0.21 mg/kg)和氯氰菊酯(0.21～0.34 mg/kg)[6]，超過歐盟和CAC標準。氯氟氰菊酯和氯氰菊酯作為擬除蟲菊酯類農藥，這類農藥的毒性一般不大，但有蓄積作用，會對人類健康產生長期、微劑量、慢性毒性作用[7-8]。近年來，國內外學者已做了很多這類農藥的分析方法探索：氣相色譜法[9-12]和氣相色譜-質譜法[13-15]、高效液相色譜測定[16-19]和高效液相色譜-質譜法[20-22]等。上述報道主要是標準品或者果蔬、茶、魚等基質的測定，有關牛奶中這2種農藥殘留檢測的報道較少。本文建立了牛奶中氯氟氰菊酯和氯氰菊酯的固相萃取凈化-氣相色譜質譜(Solid phase extraction-gas chromatography coupled to mass spectrometry，SPE-GC-MS)檢測方法，為監管監測提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料 7000三重串聯四級桿氣質聯用儀(美國，Agilent公司)；EB-280-12電子頂載天平(日本，島津公司)；T25 basic高速勻漿機(廣州儀科實驗技術有限公司)；QL-901旋渦混合器(江蘇海門其林醫用儀器廠)；RE52CS-1旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；C18固相萃取柱(CNW Technologies GmbH，2000 mg/10 mL)；毛細管氣相色譜柱SLB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國SUPELCO公司)。

新鮮牛奶，購于新疆市場。氯氟氰菊酯標準品，純度≥99%(天津農業部環境質量監督檢驗測試中心)。乙腈、丙酮、正己烷(HPLC級，美國Fisher)；其余試劑均為市售分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理 牛奶鮮樣500 mL，裝入潔凈的密封罐中，于-18 ℃編號保存。稱取15.00 g牛奶樣品，樣品中加入20 mL乙腈以及4 g硫酸鎂和1 g氯化鈉；于振蕩器上劇烈振蕩10 min，在4 200 r/min條件下離心8 min；收集上清液置于另一個100 mL雞心瓶中；繼續向殘渣中加入20 mL乙腈重復提取1次，離心；合并2次提取液，40 ℃水浴旋轉蒸發至1 mL左右，待凈化。將待凈化溶液轉移到用10 mL乙腈活化的C18固相萃取柱中，用5 mL乙腈洗滌2次樣品瓶，洗滌樣品瓶，洗滌液并入固相萃取柱中；收集全部流出液于100 mL雞心瓶中；用10 mL乙腈洗脫固相萃取柱；合并流出液，40 ℃水浴旋轉蒸發至0.5 mL左右；用5 mL正己烷進行溶劑交換，重復操作2次，將收集液旋蒸近干，氮氣吹干后，最后定容用正己烷。

1.2.2 氣相色譜質譜(GC-MS)檢測條件 氣相(GC)條件：程序升溫，初始溫度80 ℃,以35 ℃/min升溫至220 ℃,以25 ℃/min升溫至250 ℃,以4 ℃/min升溫至280 ℃,保持2.3 min;總運行時間：15.0 min;流速：1.0 mL/min；載氣：氦氣，純度≥99.999%；進樣量：1 μL；進樣口溫度：260 ℃；進樣方式：不分流進樣。

SIM條件：電子轟擊源：70 eV；離子源溫度：230 ℃；GC-MS接口溫度：280 ℃，選擇離子監測模式(SIM)條件見表1。

表1 SIM模式下待測農藥的檢測條件Table 1 Detection conditions for tested pesticides in SIM mode

1.2.3 標準溶液及基質標準溶液的配制 標準溶液配制：氯氟氰菊酯和氯氰菊酯用正己烷配制成100 mg/L標準儲備液，置于-18 ℃保存。

基質溶液標準品的配制：參照樣品前處理方法將空白的樣品(未有氯氟氰菊酯和氯氰菊酯檢出牛奶樣品為空白樣品)配制成基質溶液，用基質溶液對標準儲備液進行稀釋制成所需的定量標準品溶液，現用現配。

1.2.4 準確度與精密度測定 稱取4組經測定不含2種農藥的空白牛奶樣品，每組5個重復。在空白樣品中分別添加氯氟氰菊酯和氯氰菊酯的標準品溶液，添加水平為0.01、0.05、0.10 mg/kg和0.20 mg/kg，按照所建立的方法進行檢測，計算添加回收率和相對標準偏差(RSD)。

2 結果

2.1 樣品前處理條件優化

2.1.1 提取劑的選擇 考察了丙酮、乙腈和正己烷作為溶劑提取的效果，結果表明，當添加濃度為0.1 mg/kg時，提取劑為乙腈時,2種農藥的樣品回收率比較好，故選用乙腈為提取劑(見圖1)。

圖1 提取劑對2種農藥的提取效果(n=5)Fig.1 Extraction effect of extraction agent on 2 pesticides

2.1.2 固相萃取柱的優化 2種農藥在3種固相萃取柱[石墨化炭黑(Cabon-GCB)、弗羅里硅土(Florisil)和C18]上均有相當的保留行為，但C18固相萃取柱的回收率較前兩者略高，且重復性好。因此本方法選C18固相萃取柱凈化。

2.2 待測農藥定量和定性離子的選擇 首先，在m/z0～450之間分別對2種農藥的標準溶液(1.00 mg/L)進行全掃描，確定其保留時間(見表1)和質譜圖。在質譜圖中，選擇特征性、質量數和對稱性最高，同時重現性好且不與柱流失碎片離子相同的離子為定量離子。此外，另選擇2個特征性、質量數和對稱性較高的離子為定性離子。圖2為空白樣品、基質標準溶液和添加樣品在表1條件下得到的多反應監測總離子流圖，從圖2中可以看出，2種農藥所得到的譜峰峰形尖銳，對稱性好，各譜峰間完全分離。

2.3 線性方程、定量限、回收率和精密度

2.3.1 線性方程 按1.2.3所述配制的0.01～1.00 mg/kg內5個梯度濃度的混合基質標準品進樣，濃度分別為：0.01、0.05、0.1、0.2 mg/L和1 mg/L。在1.2.2的檢測條件下，以進樣濃度(mg/L)為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制線性方程(表2)。結果表明，在0.01～1 mg/L范圍內峰面積與進樣濃度呈良好的線性關系，決定系數R2>0.99。

2.3.2 定量限 依照3倍信噪比(S/N)對牛奶中2種農藥的檢出限(LOD)進行計算，確定為9×10-5mg/L；再依據10倍信噪比確定其定量限(LOQ)為3×10-4mg/L。通過實際添加回收試驗，最終確定牛奶中氯氟氰菊酯的定量限為0.005 mg/L，氯氰菊酯的定量限為0.01 mg/L，此時5次試驗的平均回收率分別為87.3%和92.0%，相對標準偏差(RSD)分別為8.2%和3.5%。

2.3.3 回收率和精密度 根據牛奶中氯氟氰菊酯和氯氰菊酯的最大殘留限量值以及方法的靈敏度，對牛奶樣品設定了0.01、0.05、0.10 mg/kg和0.2 mg/kg四個濃度的添加水平，牛奶中的添加回收率與相對標準偏差見表3。在0.01、0.05、0.10 mg/kg和0.20 mg/kg四個添加水平下，氯氟氰菊酯和氯氰菊酯殘留的平均回收率在83.1%～102.8%；5次重復試驗測定的相對標準偏差范圍為1.4%～9.1%，均滿足定量分析要求。

2.4 實際樣品的檢測 應用此方法對市場銷售的實際樣品進行檢測，選購的15份樣品中均未檢出這2種農藥殘留。

3 討論

牛奶中脂肪、蛋白質含量較高，基質復雜[23]，要對牛奶中的農殘進行提取，然后凈化樣品有效的提取目標物。現有文獻及標準中常用丙酮、乙腈和正己烷等作為提取劑提取動植物中的農藥殘留[1,9-10,19-20]，本試驗考察了丙酮、乙腈和正己烷作為溶劑提取的效果，發現提取劑為乙腈時2種農藥的添加回收率比較好，選擇乙腈為提取劑。這一結果可能是乙腈與水部分互溶，加入氯化鈉后，鹽析、分層和除雜效果明顯。然后，考察了擬除蟲菊酯類農藥殘留檢測常用的3種固相萃取柱[24-28]-石墨化炭黑(Carbon-GCB)、弗羅里硅土(Florisil)和C18的凈化效果，2種農藥在3種固相萃取柱上均有相當的保留行為，但C18固相萃取柱的回收率較前兩者略高，且重現性好，本方法選擇C18固相萃取柱凈化。這可能歸功于以硅膠為基質的反相C18萃取柱強疏水性選擇性，適用于從水性樣本中保留大多數有機化合物，同時其具有高鍵合密度，低流失，高回收率等特點，可以更有效地去除牛奶中脂肪和脂類等干擾物影響而保留目標物得到更高的回收率，且重現性好。

GC-MS的全掃描模式，由于掃描范圍寬、頻率低，導致背景值基線較高，會影響目標農藥的靈敏度。本方法采用選擇離子監測模式，可以有針對性地選擇目標化合物的特征離子監測，提高了方法的靈敏度，降低了干擾，每種化合物選擇3個特征離子，根據目標農藥的保留時間和對應特征離子的豐度比，可對樣品中存在的目標農藥進行定性，可排除在復雜基質中與農藥化合物保留時間一致而不是農藥的化合物的假陽性結果。如果測定樣品檢出的色譜峰保留時間與標準樣品一致，并在扣除背景后的樣品質譜圖中，所選擇的離子均出現，而且所選擇的離子豐度比與標準樣品的離子豐度比相一致(相對豐度> 50%，允許± 10%偏差;相對豐度>20%～ 50%，允許±15%偏差；相對豐度> 10%～20%，允許±20%偏差；相對豐度≤10%,允許±50%偏差)，則可判斷樣品中存在這種農藥[29]。García-Rodríguez等利用固相微萃取(SPME)方法結合GC-MS測定水產養殖海水樣本中的有機磷和擬除蟲菊酯農藥，該方法具有良好的線性度、精度和較低的LODs[15]。楊麗莉等采用C18固相萃取柱富集環境水中六六六、滴滴涕和環氧七氯，用少量有機溶劑洗脫，添加內標后利用GC-MS的SIM模式進行目標農藥的定性、定量，干擾小，測定靈敏度高[30]。本方法定量選擇一個干擾小、特征性高的離子，采用標準曲線外標法通過工作站進行，結果同樣表明，線性響應和精密度良好，準確度和靈敏度高。

表2 2種農藥的線性方程及決定系數Table 2 Linear equations,determination coefficient and linear ranges of the two pesticides

表3 2種農藥的加標回收率及其相對標準偏差Table 3 Average recovereries and relative standard deviations (RSDs) of the two pesticides (%,n=5)

長期以來國內外學者對牛奶中獸藥殘留研究較多，特別是抗生素，牛奶中農藥殘留的研究較少。國內外毒理學研究專家研究表明，牛奶中農藥殘留污染對人體健康存在微劑量、慢性毒性[7-8,31]。本試驗建立了C18固相萃取柱凈化的氣相色譜質譜法測定牛奶中氯氟氰菊酯和氯氰菊酯殘留的檢測方法，樣品前處理簡便快速且回收率高，能夠較好地排除基質干擾；定量限及精密度均能滿足痕量分析的要求，而且可以滿足歐盟等國牛奶中氯氟氰菊酯和氯氰菊酯的最大殘留限量的檢測要求，為其在畜禽養殖中違禁使用的監管監測提供理論依據和技術支撐，保障人類健康，回避潛在食用風險。