奶牛乳房炎源性肺炎克雷伯桿菌的分離鑒定和耐藥性分析

石玉祥，趙文鵬，劉 洋，劉 鋼，楊 峰，高 健，韓 博

(1.中國農業大學動物醫學院，北京 海淀 100193 ； 2.河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北 邯鄲 056038 ； 3.貴陽市動物疫病預防控制中心，貴州 貴陽 550081)

奶牛乳房炎是奶牛常見多發的疾病之一，給奶牛養殖業帶來巨大的經濟損失。在引發奶牛乳房炎的病原菌中，革蘭陰性菌(如大腸桿菌和克雷伯桿菌)和陽性菌(如金黃色葡萄球菌和鏈球菌)是主要的致病菌[1-2]。在導致奶牛乳房炎的革蘭陰性菌中，大腸桿菌和克雷伯桿菌為最常見的致病菌[3-4]。肺炎克雷伯桿菌作為一種環境性致病菌，通常可在養牛場的墊料、污水、動物體表和糞便中分離到。奶牛肺炎克雷伯桿菌性乳房炎常發生在母牛泌乳期，此期發病的奶牛不但造成其產奶量降低和奶品質下降，而且嚴重時還造成急性死亡[5]。目前，針對肺炎克雷伯桿菌引發的奶牛乳房炎的主要治療措施是抗生素療法，但此療法往往存在著預后不佳和反復發作的問題，且易造成肺炎克雷伯桿菌嚴重的耐藥性。因此，深入研究奶牛乳房炎源性克雷伯桿菌的致病性和耐藥性，為奶牛乳房炎的防治以及篩選和開發新型替抗產品提供策略。本試驗對樣品中肺炎克雷伯桿菌進行分離鑒定和耐藥性檢測，為研究奶牛乳房炎源性肺炎克雷伯桿菌的生物學特性和致病性提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2017年12月-2018年12月，在河北某大型奶牛養殖場無菌采集臨床型奶牛乳房炎牛奶樣品共計245份，用于肺炎克雷伯桿菌的分離鑒定。肺炎克雷伯菌ATCC700603，購自溫州康泰生物科技公司。

1.2 主要試劑 LB營養瓊脂、LB肉湯、腦心浸液(BHI)和胰蛋白胨大豆瓊脂培養基(TSA)，均購自北京奧博星生物技術有限責任公司；藥敏紙片，購自北京天壇藥物生物技術開發公司；脫脂綿羊血和革蘭染色試劑盒，均購自北京索萊寶科技有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒，購自北京天根生化科技有限公司；2×EasyTaqPCR Super Mix，購自北京全式金生物技術有限公司；DNA Marker，購自北京華佰泰生物科技有限公司。

1.3 細菌的分離和純化培養 將試驗所需的滅菌棉簽和TSA血平板于超凈工作臺中紫外照射20 min，用棉簽蘸取適量的奶樣在TSA血平板上劃線接種，該平板記為P1板，37 ℃恒溫培養箱中倒置培養18～24 h。取出 P1平板置于超凈臺，用滅菌的接種環挑取P1平板中單個菌落，利用四區劃線法接種血平板，該平板記為P2板，37 ℃恒溫培養箱中倒置培養18～24 h。

1.4 細菌的革蘭染色鏡檢 參照革蘭染色試劑盒說明書對細菌進行染色，并進行染色結果判定。根據染色后菌體的顏色將細菌分為2類：染色結果為藍色的細菌通常為革蘭陽性菌株，染色結果為紅色的通常為革蘭陰性菌株。

1.5 細菌的生化鑒定 對鏡檢結果為陰性的細菌進行觸媒試驗，若有產氣反應(即H2O2液滴有氣泡翻滾)，則記為觸酶陽性，無反應者記為觸酶陰性。挑取疑似菌株單菌落接種于生化管內，用封口膜將管口封閉，置于37 ℃恒溫培養箱中培養16 h。根據腸桿菌科生化鑒定手冊對試驗結果進行比對判定。

1.6 細菌的DNA鑒定 將細菌過夜培養至平臺生長期，吸取2 mL菌液，12 000 r/min離心3 min，棄去上清液獲得細菌，參照試劑盒說明書提取細菌基因組DNA。設計合成引物，上游引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，對疑似菌株16S rRNA 基因擴增，PCR產物進行凝膠電泳試驗。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR反應體系20 μL：1 μL DNA模板，上、下游引物(10 mol/L)各1 μL，2×TaqMaster Mix 10 μL和ddH2O 7 μL，混勻之后瞬時離心。PCR反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s,72℃ 90 s，34個循環；72 ℃ 10 min，擴增結束后4 ℃保存。將獲得的PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，待電泳結束后，通過Alpha Imager EC凝膠成像儀觀察電泳凝膠，拍照記錄結果。

1.7 紙片擴散法檢測細菌的藥物敏感性 將新鮮的菌液加到LB固體培養基上并涂均勻，待其干燥后，將藥敏片貼在LB固體培養基上，每個培養基放置5個藥敏片。置于37 ℃恒溫培養箱中培養12 h。用直尺測量抑菌圈的直徑，記錄數據，每種藥物做3個平行試驗。依照美國臨床和實驗室標準化研究所(CLSI) 2014版[6]執行標準判定結果：敏感(S)，中介(I)和耐藥(R)。

2 結果

2.1 肺炎克雷伯桿菌的菌落形態特征 分離獲得的細菌在LB營養瓊脂培養基上培養16 h，可見菌落呈現出圓潤、光滑和表面凸起的形態(見中插彩版圖1A)。經脫脂纖維綿羊血TSA培養基培養16 h，可觀察到菌落形態呈現出大小2 mm左右、圓形且表面濕潤的特征(見中插彩版圖1B)，均符合肺炎克雷伯桿菌的菌落特征。革蘭染色顯示，該疑似菌株革蘭染色呈紅色，為革蘭陰性菌，且該菌落形態為桿狀或短棒狀(見中插彩版圖1 C1和C2)，符合肺炎克雷伯桿菌的形態特征。此外，對分離株進行觸酶試驗，結果均為觸酶陽性，提示分離株為革蘭陰性菌。

2.2 肺炎克雷伯桿菌的生化鑒定 將分離的細菌接種于腸桿菌科微量編碼生化鑒定管中，37 ℃恒溫培養16 h后，葡萄糖顏色由紫色變成白色，賴氨酸由暗紅色變為淺紫色，鳥氨酸由棕色變為淺棕色，衛茅醇由紫色變為無色，尿素由黃色變為淺黃色且有氣泡生成。疑似菌株在葡萄糖、賴氨酸、鳥氨酸、衛茅醇和尿素生化管中均呈陽性；在硫化氫、蛋白胨水、乳糖、苯丙氨酸和枸櫞酸鹽生化管均呈陰性。通過將以上生化結果與腸桿菌科生化鑒定手冊比對分析可知，該細菌的生化鑒定結果符合肺炎克雷伯桿菌的生化特征。

2.3 肺炎克雷伯桿菌的分子鑒定 提取細菌基因組DNA，經PCR擴增，將45株疑似菌株的PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。結果顯示，疑似菌株可擴增出大小一致的條帶，且與目的條帶大小相符合，約為1 500 bp，如圖2所示，這與肺炎克雷伯桿菌的基因組大小一致。

圖2 部分疑似肺炎克雷伯桿菌PCR擴增產物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of PCR amplification products of suspected Klebsiella pneumoniaeM：DNA Marker； 1～16：部分離菌株的PCR產物條帶； 17：肺炎克雷伯桿菌PCR產物條帶M:DNA Marker; 1～16:PCR product band of partial isolates;17:PCR products of Klebsiella pneumoniae

2.4 肺炎克雷伯桿菌的耐藥性檢測 分離獲得的肺炎克雷伯桿菌的藥敏試驗結果見表1。肺炎克雷伯桿菌對青霉素、四環素、慶大霉素和克林霉素的耐藥率分別為73.3%、53.3%、48.9%和46.6%，提示本次分離獲得的肺炎克雷伯桿菌耐藥性嚴重；對頭孢氨芐、卡那霉素和頭孢喹肟的敏感率分別為60%、46.7%和44.4%。

表1 肺炎克雷伯桿菌的耐藥性分析Table 1 Drug resistance analysis of Klebsiella pneumoniae

3 討論

通過細菌形態學觀察、生化鑒定和PCR擴增試驗確認分離菌株為肺炎克雷伯桿菌；藥敏試驗結果顯示，肺炎克雷伯桿菌對青霉素、四環素、慶大霉素和克林霉素的耐藥率分別為73.3%、53.3%、48.9%和46.6%，對頭孢氨芐、卡那霉素和頭孢喹肟3種藥物敏感。

奶牛乳房炎是由革蘭陰性菌和革蘭陽性菌感染乳腺上皮細胞引起的乳腺疾病。在臨床型奶牛乳房炎中，由病原菌感染引發的乳房炎嚴重影響產奶量、乳品質以及增加治療成本和死淘率，給乳制品行業造成重大經濟損失[7]。肺炎克雷伯桿菌是一種常見的環境性致病菌，針對該菌引發的奶牛乳房炎通常采用抗生素進行治療，長期使用抗生素導致病原菌耐藥、藥物殘留和肉奶品質安全等問題日益突出[8-9]。本試驗通過采集臨床型乳房炎患病奶牛的乳樣，對奶樣中的肺炎克雷伯桿菌進行分離鑒定以及耐藥性分析，為進一步研究奶牛乳房炎性肺炎克雷伯桿菌的致病性提供依據。

本試驗分離獲得的45株疑似肺炎克雷伯桿菌菌株在培養基上呈現出灰白色、黏液狀、光滑、灰白色與粉紅色交錯、形態大小一致的菌落，這與張超等[10]報道的肺炎克雷伯桿菌的菌落形態特征相似。經革蘭染色鏡檢觀察，發現疑似菌株革蘭染色為紅色，表明該菌為革蘭陰性菌，其形態呈現出單個、成雙或短鏈狀排列、短棒狀或桿狀的特征，這與Lin等[11]報道的肺炎克雷伯桿菌形態特征相符合。該疑似菌株的觸酶試驗結果顯示均有氣泡產生，這也進一步表明本試驗分離的疑似菌株為革蘭陰性菌。肺炎克雷伯桿菌屬于腸桿菌科，具有獨特的生物化學特性。生化結果顯示，疑似菌株可分解葡萄糖、賴氨酸、鳥氨酸、衛茅醇和尿素；對硫化氫、蛋白胨水、乳糖、苯丙氨酸和枸櫞酸鹽則不分解，與腸桿菌科生化鑒定手冊比對分析可知，分離株生化鑒定結果符合肺炎克雷伯桿菌的生化特征，且這與林雅等[12]分離出的牛源肺炎克雷伯桿菌生化結果基本一致。隨著分子生物學技術的發展，對病原菌的檢測方法也從細菌的表型觀察逐漸向病原菌的遺傳生物學特征鑒定轉變，一些敏感性高、特異性強的分子快速檢測生物學技術(如PCR)在病原菌的檢測中得到了廣泛的應用。本試驗的瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，分離株DNA片段大小與目的菌株條帶大小一致，提示所獲得的45株分離株為肺炎克雷伯桿菌。通過分析總結以上結果可知，本試驗分離所得的45株細菌為肺炎克雷伯桿菌，分離率為18.4%，表明河北地區奶牛乳房炎源性肺炎克雷伯桿菌的流行率比較高。

抗生素在畜牧養殖業中得到了廣泛應用，但由此造成的細菌耐藥和藥物殘留等問題日益突出，也成為當今眾多國家公共衛生安全領域最為嚴重的問題之一。近年來，肺炎克雷伯桿菌的耐藥情況變的愈發嚴重，甚至出現多重耐藥的現象[13-14]。本試驗對分離所得的45株肺炎克雷伯桿菌進行藥敏試驗檢測，發現肺炎克雷伯桿菌對青霉素的耐藥達到70%以上，對四環素、克林霉素、氨芐西林和慶大霉素的耐藥率在40%～55%，對頭孢曲松、頭孢噻肟和卡那霉素3種藥物敏感，這與王樂等[15]的報道有區別。細菌耐藥性的不同與獲得病原菌的地域、季節和牛場管理模式以及牛場日常用藥等有密切關系，而且同一種屬細菌對相同藥物的耐藥性也存在一定差異。本試驗結果表明，從臨床型乳房炎患牛奶樣中分離的肺炎克雷伯桿菌表現出嚴重的耐藥性，說明了河北地區引起奶牛乳房炎的肺炎克雷伯桿菌的耐藥性問題比較嚴重，尋求新型替抗產品治療肺炎克雷伯桿菌引起的奶牛乳房炎迫在眉睫。

綜上所述，本試驗通過從細菌的菌落生長形態特征、生化特性和分子遺傳學特征等方面對分離疑似菌株進行鑒定，確定分離45株細菌屬于肺炎克雷伯桿菌，藥敏試驗結果表明，分離的肺炎克雷伯桿菌具有嚴重的耐藥性，為河北省肺炎克雷伯桿菌引發的奶牛乳房炎防治提供科學理論依據。