美洲大蠊提取物Ento-A對大鼠急性胃黏膜損傷的保護作用

羅榮耀，張晶娜，偰 棲，馬旋壘，劉勝帥，李 玥，何 苗

(1.大理大學藥學與化學學院 云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室 藥用特種昆蟲開發國家地方聯合工程研究中心 中國西南藥用昆蟲及蛛形類資源開發利用協同創新中心，云南 大理 671000 ； 2.大理白族自治州人民醫院藥劑科，云南 大理 671000)

美洲大蠊(PeriplanetaamericanaL.)俗稱蟑螂，具有增強免疫、促進血管增生、組織修復、抗炎消腫等作用[1-2]。以美洲大蠊為原料制成的康復新液，臨床應用顯示，能促進新生肉芽組織增長，加速病損組織修復，同時促進創面血液循環，增強創面免疫力，對酒精性胃黏膜損傷具有明顯的保護作用[3]。急性胃炎是消化內科常見的消化道疾病，生活中過度飲酒及阿司匹林等非甾體類藥物的不合理應用是其常見的外源性引發因素，其病理改變在胃黏膜處常表現為水腫、充血、出血及糜爛甚至潰瘍等[4]。本試驗采用80%乙醇與20 mg/mL水楊酸鈉溶液等體積的混合液灌胃建立大鼠急性胃炎模型，考察新工藝制備的美洲大蠊提取物Ento-A對急性胃炎胃黏膜的保護作用及其機制，為其應用于臨床提供實驗基礎和理論依據。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物 SPF級雄性Wistar大鼠，體質量250～300 g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，合格證號：SCXK(遼)2015-0001。飼養：清潔級，室溫16～22 ℃，相對濕度60%，自由飲食。

1.2 藥物與試劑 美洲大蠊提取物Ento-A(大理大學昆蟲生物醫藥研究院制備，批號：20160901)；西咪替丁(昆藥集團股份有限公司，批號：171003-6)；康復新液(四川好醫生攀西藥業股份有限責任公司，批號：13170705)；無水乙醇(天津市福晨化學試劑廠，批號：20160312)；水楊酸鈉(廣東汕頭市西隴化工廠，批號：0210151)；ELISA試劑盒(前列腺素：PGE2，批號：20180201；環氧合酶：COX-2，批號：20180201C；反應蛋白：CRP，批號：20180201；轉化生長因子：TGF-β1，批號：20180205)，均購自南京建成生物工程研究所；氯化鈉注射液(貴州天地藥業有限責任公司，批號：A15022001)。

1.3 試驗儀器 臺式冷凍離心機(上海離心機機械研究所，型號：TL-16R)；紫外可見光分光光度計(北京普析通用有限公司，型號：T-6新世紀)；電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司，型號：ML204/02)；酶標儀(奧地利安圖斯公司，型號：201型)；渦旋儀(海門市其林貝爾制造有限公司，型號：VORTFX-5)。

2 方法

2.1 美洲大蠊提取物Ento-A的制備 美洲大蠊藥材5 kg，粉碎，加水50 L，室溫浸泡過夜，在95 ℃下回流提取3次，每次3 h；收集提取液，過濾，濃縮至相對濃度為1.10～1.20 g/mL；加入95%乙醇，調節含醇量至50%～70%，攪拌30 min，靜置48 h，過濾，回收乙醇，濃縮至相對濃度為1.05～1.10 g/mL，冷藏庫放置24 h，棄去上層油脂，下層溶液過濾，濾液減壓濃縮至稠膏。

2.2 分組給藥及造模 將48只Wistar大鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、西咪替丁組[100 mg/(kg·bw)]、康復新液組[3 mL/(kg·bw)]、美洲大蠊提取物Ento-A低劑量組[150 mg/(kg·bw)]、高劑量組[300 mg/(kg·bw)]，共6組，每組8只。各組大鼠分別灌胃給予相應藥物，正常對照組與模型對照組給予生理水[3 mL/(kg·bw)]，每天1次，連續給藥8 d。末次給藥前24 h，禁食不禁水，給藥90 min后，各組灌胃給予80%乙醇與20 mg/mL水楊酸鈉溶液等體積混合液(1 mL/100 g)，正常對照組以生理鹽水代替造模劑平行操作。

2.3 動物處理 造模1 h后，10%水合氯醛麻醉大鼠，剖檢，腹主動脈采血，4 ℃下靜置4 h，3 500 r/min離心10 min，取上層血清檢測COX-2、PGE2、CRP的含量。取出胃，沿胃大彎剪開胃壁，用生理鹽水清洗胃內容物，觀察胃炎發生情況，將胃組織橫向剪取一半稱重，制成10%組織勻漿液，3 500 r/min離心10 min，取上清液檢測TGF-β1含量，另一半胃組織用10%福爾馬林固定，制作病理切片，參照國家食品藥品監督管理局(CFDA)頒布的保健食品“對胃黏膜損傷有輔助保護功能評價方法”項下的鏡下評分標準進行病理組織學評分[5]。評分方法：以充血、出血、黏膜細胞變性壞死在整個黏膜上皮層的累積程度分為五級。充血權重為1，出血權重為2，上皮細胞變性壞死權重為3，評分標準如表1所示，按照公式“病變總積分=充血積分+出血積分×2+上皮細胞變性壞死積分×3”計算胃黏膜病變總積分。

3 結果

表1 急性胃黏膜損傷鏡下評分標準Table 1 Scorig standard on acute gastric mucosal injury in rats under microscope

3.1 美洲大蠊提取物Ento-A對急性胃炎肉眼觀察的影響 正常對照組大鼠胃黏膜呈粉紅色，有光澤；模型對照組大鼠胃黏膜色澤暗紅，充血明顯，胃竇部黏膜可見程度不同的點狀或灶狀糜爛；與模型對照組比較，西咪替丁組、康復新液組、美洲大蠊提取物Ento-A各劑量組胃黏膜呈粉紅色，水腫和充血現象不同程度改善。結果如中插彩版圖1所示。

3.2 美洲大蠊提取物Ento-A對急性胃黏膜損傷大鼠血清生化指標的影響 與正常對照組比較，模型對照組血清PGE2、COX-2、CRP的含量顯著升高(P<0. 01)；與模型對照組比較，康復新液組、西咪替丁組及Ento-A各劑量組血清COX-2、PGE2、CRP的含量顯著降低(P<0. 01)。結果如圖2所示。

圖2 美洲大蠊提取物Ento-A對急性胃黏膜損傷大鼠血清PGE2、COX-2、CRP的含量的影響Fig 2 Influence of Ento-A on levels of PGE2,COX-2,CRP in rats serum of acute gastric mucosal injuryA：正常對照組； B：模型對照組； C：西咪替丁組； D：康復新組； E：Ento-A低劑量組; F：Ento-A高劑量組；下圖同A:Normal control group; B:Model control group; C:Cimetidine group; D:Kang Fu-xin group; E:Ento-A low dose group; F:Ento-A high dose group. The same as below與正常對照組比較，*：P<0. 05，**：P<0. 01；與模型對照組比較，#：P<0. 05，##：P<0. 01；下圖同Compared with normal control group,*:P<0. 05,**:P<0. 01; Compared with model control group,#:P<0. 05,##:P<0. 01. The same as below

3.3 美洲大蠊提取物Ento-A對急性胃黏膜損傷大鼠胃組織TGF-β1的影響 與正常對照組比較，模型對照組TGF-β1顯著降低(P<0. 01)；與模型對照組比較，西咪替丁組、康復新液組、Ento-A各劑量組TGF-β1含量升高(P<0. 01或P<0. 05)，且Ento-A 高劑量對TGF-β的影響與西咪替丁相當。結果如圖3所示。

圖3 美洲大蠊提取物Ento-A對急性胃黏膜損傷大鼠胃組織TGF-β1的含量的影響Fig.3 Influence of Ento-A on TGF-β1 level in tissue in rats of acute gastric mucosal injury

3.4 美洲大蠊提取物Ento-A對急性胃黏膜損傷大鼠的胃組織病理學評分 正常對照組大鼠胃黏膜結構層次清楚，腺體排列整齊，無充血及出血現象；模型對照組大鼠胃組織表皮上層有明顯損傷，黏膜層充血，可見大量紅細胞于血管外聚集，出血嚴重；黏膜上層腺體結構紊亂或壞死；各給藥組大鼠胃組織損傷情況不同程度改善。與正常對照組比較，模型對照組充血、出血、上皮細胞變性壞死評分及病變總積分顯著升高(P<0.01)；與模型對照組比較，西咪替丁組、康復新液組、Ento-A各劑量組充血、出血、上皮細胞變性壞死評分及病變總積分顯著降低(P<0. 01)。Ento-A各劑量組對大鼠胃組織病變的作用與西咪替丁相當。評分結果如圖4所示，各組大鼠胃病理切片圖如中插彩版圖5所示。

圖4 美洲大蠊提取物Ento-A對急性胃黏膜損傷大鼠的胃組織病理學評分的影響Fig.4 Influence of Ento-A on pathological score on gastric tissue in rats of acute gastric mucosal injury

4 討論

水楊酸等非甾體類抗炎藥可抑制環氧化酶，削弱胃黏膜屏障，抑制胃上皮碳酸鹽分泌，減弱胃黏膜的修復和更新，可進一步減少肉芽組織的生長，使潰瘍愈合延遲；另外還可抑制氧化磷酸化過程，使ATP產生減少，引起黏膜通透性增加，促進對酒精的吸收。高濃度的酒精被胃黏膜吸收后，破壞胃黏膜屏障，引起黏膜急性損傷，包括出血、水腫、上皮損傷和炎性細胞浸潤等，進一步引起大鼠胃黏膜上皮各類細胞不同程度地變性、壞死，間質血管瘀血等[6]。本試驗中模型對照組胃黏膜色澤暗紅，充血明顯，胃竇部黏膜呈程度不同的點狀或灶狀糜爛情況，由此驗證急性胃炎模型制備成功。

COX-2為誘導型環氧合酶，在正常組織中多不表達，當身體組織受到某種刺激如外傷、感染等時，會被激活并由炎癥部位組織細胞迅速合成，其也是前列腺素合成過程中重要的限速酶[7]；PGE2為后炎癥因子，在組織正常生理狀態下含量很低，急性炎癥時COX-2增高可促進PGE2的表達，兩者均為引發急性炎癥的重要因子，共同參與炎癥的病理過程[8-9]。CRP可靈敏地反應機體炎癥活動，其升高可以提示炎癥組織的大小或活動性，當機體受到炎癥反應刺激時，肝細胞便迅速合成分泌大量的CRP，從而引起血清CRP濃度急劇上升[10]。本試驗中，Ento-A各劑量組COX-2、PGE2及CRP的表達均顯著降低，提示美洲大蠊提取物可通過抑制炎性因子分泌，減輕炎癥反應，從而降低了急性炎癥對胃黏膜組織的損傷程度。TGF-β1是一種重要的具有較強抗炎作用的多效細胞因子，機體炎癥時可趨化成纖維細胞和炎癥細胞向傷口聚集，促進成纖維細胞大量合成膠原蛋白，誘導創面底部小血管的內皮細胞的增生、分裂，誘導肉芽組織生長和表皮形成[11]。本試驗中，Ento-A各劑量組TGF-β1組織水平均顯著升高，提示美洲大蠊提取物能通過增強胃黏膜再生和修復的潛力，從而增加胃黏膜對外來刺激因子的抵抗力，一定程度上減輕急性炎癥時胃壁黏膜的損傷程度。

綜上所述，美洲大蠊提取物Ento-A可能是通過調控炎癥反應因子PGE2、COX-2、CRP及TGF-β1的表達水平，來提高胃黏膜上皮對外來刺激的免疫力，最終在急性胃炎發生時表現出對胃黏膜的保護作用。