3株豬源多動物鏈球菌的分離與鑒定

王麗揚，王鉉皓，許倩倩，高 尚，王鵬勇，王彥紅

(1. 揚州大學獸醫學院，江蘇 揚州 225009 ； 2. 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，江蘇 揚州 225009)

多動物鏈球菌(Streptococcuspluranimalium,SP)最早由Devriese(1999年)從患有隱性乳房炎的奶牛,及奶牛的生殖道、扁桃體, 金絲雀的嗉囊、呼吸道,以及綿羊和貓的扁桃體中分離[1]，經過分離鑒定確認其為鏈球菌中的新種。這種新的鏈球菌還被發現與小牛腦膜炎相關，可能是敗血癥的后遺癥[2]。也有相關研究指出，多動物鏈球菌可以引起肉雞的心內膜炎和敗血癥[3]。眾多臨床病例表明，這種新的鏈球菌主要感染動物為牛和家禽，尚未出現有關豬感染該鏈球菌的報道，2018年不同時間，從揚州大學動物醫院就診的病例中分離出3株細菌，因此，對豬源多動物鏈球菌的生化、生物學特性進行相關研究，為進一步對其流行病學、免疫與防治的深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病例背景 2018年3月，江蘇省揚州儀征某豬場共飼養了200頭60日齡的豬，出現幾頭死亡，送檢1頭病死豬來剖檢，該豬生前出現呼吸道癥狀，10多天后即死亡，死前皮膚發紫，口中流有鼻涕。剖檢可見肺臟實變，有結節，鼻腔、氣管內含有大量濃稠分泌物。

2018年5月，揚州江都某豬場送檢仔豬1頭，該豬場共飼養了600頭母豬，所產仔豬為3～5日齡，幾乎每窩均有發病，病豬主要表現為水樣腹瀉、消瘦、脫水死亡，病程3～5 d。剖檢可見腎臟呈點狀出血。

2018年9月，淮安洪澤送檢病死仔豬1頭，該豬場共飼養了80頭母豬，產仔前后母豬仔豬均表現正常，斷奶后至3月齡之間出現死亡，7～9月份陸續死亡200頭。剖檢可見心肌外膜有較多纖維素附著，肝臟稍腫、腎出血與貧血相交替，脾小端梗死，腸系膜淋巴結水腫，肺淤血、水腫。

1.2 培養基 瓊脂粉與氯化鈉，購自國藥集團化學試劑有限公司；綿羊血，購自杭州微生物試劑有限公司。綿羊血平板按照通用組方自行配制。

1.3 主要試劑 本試驗所用生化鑒定管和藥敏試紙片，均購自杭州微生物試劑有限公司。16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit試劑盒，購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.4 實驗動物 清潔級6周齡BALB/c小鼠8只，雌雄各半，健康狀態良好,購自揚州大學獸醫學院比較醫學中心。

1.5 主要儀器 超凈工作臺(型號為SW-CJ-IL)，購自杭州微生物試劑有限公司；恒溫培養箱(型號為GNP9080)，購自上海精宏實驗設備有限公司；DNA擴增儀(型號為4484073)，購自北京智杰方遠科技有限公司；奧林巴斯CX系列生物顯微鏡(型號為CX21FS1C)，購自奧林巴斯(廣州)工業有限公司；凝膠電泳儀(型號為DYCP-31DN)，購自北京六一生物科技有限公司。

1.6 細菌分離 分別取3例病豬的肝臟、肺臟、脾臟、腎臟、皮下水腫液無菌接種于血瓊脂平板(含5%綿羊血)，于37 ℃條件下培養24 h，觀察結果。24 h后無菌挑取血瓊脂平板上的單個菌落進行純培養，再挑取單個菌落進行革蘭染色鏡檢。

1.7 生化試驗 無菌挑取分離菌的純培養物分別接種于乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇等一系列生化反應管中并置于37 ℃條件下培養48 h，觀察結果。

1.8 16S rDNA鑒定 通過煮沸裂解法制備3株分離菌的DNA模版，按照寶生物工程(大連)有限公司16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit方法進行PCR擴增，取5 μL擴增產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，將剩余的PCR擴增產物送至金斯瑞生物科技公司測序。

1.9 小鼠攻毒試驗 將8只小鼠分為2組，每組4只，雌雄各半，第1組用于攻毒，第2組作為對照。取1株細菌搖菌過夜，菌液濃度約為7×108CFU/mL，小鼠腹腔注射0.4 mL。對照組每只腹腔注射0.4 mL生理鹽水。置于溫暖舒適的室內，給予相同鼠糧及飲水，觀察小鼠狀態。

1.10 藥敏試驗 采用常規藥敏紙片擴散法，無菌操作將3株分離菌的純培養物均勻涂抹于血平板上并置于37 ℃培養箱中培養24 h。藥敏紙片有：美洛西林(75 μg/片)、復方新諾明(23.75 μg/片)、氟苯尼考(30 μg/片)、環丙沙星(5 μg/片)、慶大霉素(10 μg/片)、丁胺卡那霉素(30 μg/片)、諾氟沙星(10 μg/片)、阿莫西林(20 μg/片)、多西環素(30 μg/片)、頭孢曲松(30 μg/片)、多黏菌素B(300 U/片)、頭孢哌酮/舒巴坦普生(75/75 μg/片)、左氧氟沙星(5 μg/片)、頭孢噻肟(30 μg/片)、新霉素(30 μg/片)、妥布霉素(10 μg/片)、鏈霉素(10 μg/片)、卡那霉素(30 μg/片)。

2 結果

2.1 細菌分離 3例病死豬的肝臟、肺臟、脾臟、腎臟及皮下水腫液無菌接種于血瓊脂平板，24 h后從第1例病死豬肺臟中分離出細菌，第2例從腎臟中分離到細菌，第3例從皮下水腫液中分離到細菌，均長出邊緣整齊、濕潤、不透明、乳白色的完全溶血小菌落(見中插彩版圖1)。將分離到的3株細菌分別編號為SP1、SP2、SP3。對純化后的菌落進行革蘭染色后，在油境下觀察，分離菌株為革蘭陽性球菌，呈鏈狀或團塊狀排列(見中插彩版圖2)。

2.2 生化試驗 分離菌株能夠發酵蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、七葉苷、纖維二糖，不能發酵阿拉伯糖、山梨醇、蜜二糖(表1)，與多動物鏈球菌的生化特性基本一致。

表1 3株分離菌株的生化試驗結果Table 1 The results of 3 isolates biochemical test

2.3 16S rDNA鑒定結果 將3株分離菌的DNA模版進行PCR擴增后，均得到500 bp左右的目的條帶，擴增產物送至金斯瑞生物科技公司進行測序，測序結果與NCBI數據庫中的多動物鏈球菌CP022601.1具有99%的同源性，可確定分離菌株為多動物鏈球菌。

2.4 小鼠攻毒試驗 攻毒24 h后試驗組中4只小鼠死亡，對照組正常。對死亡小鼠進行剖檢可發現炎癥反應明顯，肝臟、脾臟、腎臟腫大，腹腔器官粘連，胸腔有滲出液(見中插彩版圖3)。采集肝臟制作觸片并進行美藍染色，于顯微鏡下觀察可見大量鏈狀或團塊狀的球菌，與分離菌鏡檢形態一致(見中插彩版圖4)。

2.5 藥敏試驗 結果(見表2)顯示，該分離株對頭孢噻肟、鏈霉素、卡那霉素、妥布霉素、慶大霉素、復方新諾明、諾氟沙星、多西環素8種藥物具有較強的耐藥性，對美洛西林、阿莫西林、頭孢曲松鈉3種藥物敏感。

表2 3株分離菌藥敏結果Table 2 The results of 3 isolates drug susceptibility (mm)

3 討論

分別從送檢豬的肺、腎、皮下水腫液分離到了3株細菌，通過生化試驗、16S rDNA鑒定得出3株分離菌為多動物鏈球菌(SP)。多動物鏈球菌作為一種新型致病菌，可以感染牛、綿羊、羊駝和野雞等多種動物[4]。自首次發現以來，世界多地均有分離到該菌的報道，國內也有從山羊鼻腔分泌物中分離到該菌報道[5]。而從豬的體內分離到尚屬首次，從病例背景分析，這種細菌感染多見于幼齡豬。根據分離到菌株的部位也能發現這是一種能夠全身多臟器感染的致病菌。此外，多動物鏈球菌也被發現與人類疾病相關，曾從人類硬膜下膿腫液中分離到該細菌[6]。類似鏈球菌感染人的報道屢見不鮮，由此可以看出，多動物鏈球菌具有潛在的跨物種傳播能力。目前有關多動物鏈球菌的研究并不充分，也缺乏相應的快速診斷技術[7]。因此，有必要進一步研究多動物鏈球菌的發病機理將有助于開發預防和治療該細菌感染的策略。

經過一系列藥敏試驗分析，3株細菌均對鏈霉素、妥布霉素、卡那霉素、慶大霉素耐藥，這與氨基糖苷類抗生素自身特點有關，對革蘭陽性菌的作用較弱相關，此外，也可能臨床大量使用此類藥物有關。另外發現該菌株對其他抗生素具有耐藥性，這就導致臨床上很多藥物治療無效，為了減少藥物的濫用以及避免耐藥性的產生，用藥時應在藥敏試驗的科學指導下正確的應用，以免造成不必要的損失，對于本病的治療可根據藥敏結果作為參考，使用美洛西林、阿莫西林、頭孢曲松鈉等藥物。