蘭州地區(qū)奶牛臨床型乳房炎主要病原菌分離鑒定及耐藥性分析

趙祎云，隋國燕，唐 峰，李世宏

(1. 錦州醫(yī)科大學畜牧獸醫(yī)學院 遼寧省畜產(chǎn)品質(zhì)量與安全工程重點實驗室，遼寧 錦州 121001 ； 2. 中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室，甘肅 蘭州 730050)

奶牛乳房炎(Bovine mastitis)是由多種病原微生物感染或外傷所引發(fā)的一種綜合征，是影響世界奶牛業(yè)發(fā)展的主要疾病之一[1]。奶牛乳房炎可導致產(chǎn)乳量下降、乳蛋白及乳糖含量下降等情況，從而影響乳品質(zhì)量，部分病原菌可以將自身產(chǎn)生的毒素排入到牛乳中，引發(fā)食品安全問題[2]。此外，長期使用抗生素治療奶牛乳房炎，可導致乳品中抗生素殘留超標，進而引起食用者過敏、正常菌群失調(diào)或細菌耐藥性[3]。在我國，奶牛乳房炎的感染率高達70%。據(jù)報道，奶牛乳房炎導致我國每年30億元經(jīng)濟損失，損失金額高于發(fā)達國家[4]。

奶牛乳房炎的致病菌種類繁多是導致該病復雜性的重要原因之一[5]。目前，人們發(fā)現(xiàn)150多種病原微生物都可引起乳房炎。在我國，鏈球菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌是乳房炎主要致病菌[6]。但是，不同地區(qū)的養(yǎng)殖場中，引起該病的病原不盡相同[7-8]，這給診療工作帶來壓力。此外，長期的抗生素治療還引起了臨床致病菌耐藥性的發(fā)生，進一步增加了乳房炎治療的難度。因此，本試驗通過采集2019年春、夏季蘭州某規(guī)模化奶牛養(yǎng)殖場患有臨床型乳房炎的病牛奶樣，進行主要致病菌的分離鑒定以及藥敏試驗，為控制和治療乳房炎提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取蘭州地區(qū)某大型荷斯坦奶牛繁育基地患有臨床型乳房炎的奶牛作為研究對象。患病乳區(qū)出現(xiàn)紅、腫、熱、痛等癥狀，且其他方面健康的泌乳期奶牛；乳汁中出現(xiàn)血液、絮狀、凝塊及清水等癥狀的泌乳期奶牛。

1.2 主要試劑 甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基(MSA)、MH瓊脂培養(yǎng)基、BETA-SSA瓊脂培養(yǎng)基，均購自青島海博生物技術(shù)有限公司；伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基(EMB)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(MCA)、90 mm血瓊脂平板成品培養(yǎng)基、腦心浸出液肉湯(BHI)，均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；脫纖維綿羊血，購自廣州鴻泉生物科技有限公司；細菌DNA提取試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司；16S rDNA PCR擴增試劑盒、DL-2 000 DNA Marker，均購自大連TaKaRa有限公司；K-B藥敏紙片，購自英國OXOID公司。

1.3 病料采集 2019年5-8月，從蘭州某規(guī)模化荷斯坦奶牛養(yǎng)殖場采集患有臨床型乳房炎奶牛奶樣共110份。采集樣品前先用溫水清洗整個乳區(qū)及乳頭，并使用75%乙醇消毒，雙手消毒后棄去前3把奶，將奶樣裝入無菌采樣管中，每管5 mL標記編號和乳區(qū)后放入裝有冰袋的采樣箱中，24 h內(nèi)帶回實驗室接種。

1.4 方法

1.4.1 主要病原菌分離純化 輕搖混勻樣品后取200 μL乳樣加入2 mL BHI培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩培養(yǎng)18～24 h，用無菌接種環(huán)取富集培養(yǎng)物劃線接種于血瓊脂平板、麥康凱瓊脂、BETA-SSA瓊脂、高鹽甘露醇瓊脂培養(yǎng)基[9]，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落形態(tài)，挑取典型形態(tài)菌落進行純化培養(yǎng)，將已經(jīng)純化的細菌再挑單菌落至BHI培養(yǎng)基，于37 ℃搖床 24 h 擴大培養(yǎng)，并加入40%甘油于-80 ℃保存。

1.4.2 16S rDNA擴增 將凍存的菌液復蘇后根據(jù)細菌DNA提取試劑盒說明書提取DNA，以提取的DNA作為PCR模板，反應體系如下：PCR Premix 12.5 μL，F(xiàn)orword Primer 0.25 μL、Reverse Primer 0.25 μL、16S-free H2O 11 μL、DNA模板1 μL，共25 μL。PCR擴增條件為：94 ℃預變性 5 min；95 ℃變性1 min，53 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1.5 min，30個循環(huán)；最終延伸溫度72 ℃ 5 min。反應結(jié)束后使用1%瓊脂糖凝膠進行檢測，目的片段為550 bp，將PCR產(chǎn)物送至西安擎科生物有限公司進行測序，結(jié)果在NCBI上進行BLAST比對，確定細菌種屬。

1.4.3 藥敏試驗及耐藥性分析 對分離到的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌進行耐藥性檢測。根據(jù)奶牛乳房炎常用治療藥物，選擇10種抗生素(青霉素G、紅霉素、頭孢噻肟、四環(huán)素、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星、阿莫西林、氟苯尼考)進行藥物敏感試驗。根據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會(Clinical and laboratory standard institute，CLSI)[10]，每個樣品設置2個平行。

2 結(jié)果

2.1 主要病原菌分離純化及16S rDNA鑒定 110份樣品經(jīng)分離培養(yǎng)、純化以及16S rDNA測序，共有89份樣品中分離出病原菌，其中包括大腸桿菌33株，金黃色葡萄球菌15株，鏈球菌23株，除此之外，本次試驗還有22株非主要病原菌被分離出，具體細菌分離鑒定結(jié)果見表1。

2.2 耐藥性分析 藥敏試驗結(jié)果顯示：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌對青霉素和阿莫西林均表現(xiàn)出高度耐藥，其次是紅霉素和鏈霉素，而對慶大霉素、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、氟苯尼考、卡那霉素的耐藥率均在10%左右，而大腸桿菌和鏈球菌對于土霉素的耐藥率為21.1%和29%，高于金黃色葡萄球菌的7.3%。3類主要病原菌耐藥檢測結(jié)果見表2。

3 討論

導致奶牛乳房炎的病原體有多種，主要包括細菌、真菌、支原體、病毒等，但其中90%以上由細菌引起。引起奶牛乳房炎的細菌主要分為環(huán)境致病菌和傳染性致病菌2類，環(huán)境致病菌包括大腸桿菌、綠膿桿菌、棒狀桿菌等；傳染性致病菌包括無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌等[11]。本試驗采集到的110份臨床型乳房炎奶樣品中共有89份樣品檢測出病原菌，病原檢出率為80.9%；混合感染有4份，占所有樣品的3.6%。經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，該牛場臨床型乳房炎主要病原菌主要為大腸桿菌(35.5%)、金黃色葡萄球菌(16.1%)、無乳鏈球菌(14.0%)、停乳鏈球菌(7.5%)和乳房鏈球菌(3.2%)。其中大腸桿菌占比最高為35.5%，這與王丹等[11]、張莉莉[12]對蘭州地區(qū)大腸桿菌檢出結(jié)果基本一致。大腸桿菌作為最主要的環(huán)境致病菌之一，其主要是通過墊料、糞便等環(huán)境因素傳播。建議在日常管理方面，應加強環(huán)境衛(wèi)生管理，勤換墊料，勤對牛舍消毒，從源頭減少環(huán)境致病菌的感染。無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌作為傳染性致病菌中最重要的3種，在本次試驗中占總分離細菌的37.6%。本結(jié)果與李宏勝等[13]、羅金印等[14]在蘭州的調(diào)查結(jié)果相比有明顯的改善。傳染性致病菌由于超級耐藥菌(耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，MRSA)的出現(xiàn)治療十分困難，長期影響奶牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，近些年隨著科技的進步，帶有自動消毒的擠奶設備的應用與規(guī)范的擠奶流程，都能有效改善由傳染性致病菌引起的乳房炎[15]。本試驗還分離出除以上3類主要致病菌外的22株病原菌，其中主要為克雷伯菌和沙雷菌等條件致病菌且單種細菌分離比例均不足細菌總數(shù)的2%，但在日常生產(chǎn)中仍需加以防范，避免此類細菌感染而帶來不必要的損失。

表1 細菌分離鑒定結(jié)果Table 1 Results of isolation and identification of bacteria

表2 病原菌耐藥檢測結(jié)果Table 2 Detection results of drug resistance of pathogenic bacteria

藥敏試驗結(jié)果顯示，受試病原菌對青霉素G和阿莫西林的耐藥率高達70%以上，最高達到94.0%，對鏈霉素的耐藥率也達到了75.7%，這一結(jié)果與文獻報道的結(jié)果基本一致[16-17]。導致這一結(jié)果的主要原因，是由于青霉素和鏈霉素是早期治療奶牛乳房炎最常用的藥物，在長期大量的使用這2種藥物后使這些常見致病菌對其產(chǎn)生了耐藥性。本試驗結(jié)果中，頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、氟苯尼考、卡那霉素這4種藥物對受試細菌的抑制效果極為顯著，均在10%以下。由于近些年來，細菌的耐藥性逐漸受到人們的重視，獸醫(yī)工作人員在治療奶牛乳房炎時會選用敏感藥物，并采用交叉用藥、聯(lián)合用藥等方法。這在一定程度上緩解了病原菌耐藥情況的發(fā)生。因此，根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，建議該奶牛場主要選擇以上4種敏感藥物，并采用交叉用藥、聯(lián)合用藥等方法給藥。

雖然，針對乳房炎病原菌的疫苗正大量投入研究中，但是由于不同地區(qū)的奶牛乳房炎病原菌種類繁多、危害程度各異，這導致現(xiàn)有的疫苗不能有效的針對每一種病原菌加以預防[18]。在此背景下，嚴格規(guī)范的日常管理和科學合理的用藥治療仍是防治奶牛乳房炎的重要方法。