1例副雞禽桿菌和鼻氣管鳥(niǎo)桿菌混合感染的診斷

梅 晨，王琪琎，先 宏，張 雪，胡 偉，王宏俊

(北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京 海淀 100097)

2019年3月，北京某蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)大量以流鼻涕、打噴嚏、面部腫脹和食欲下降等為主要癥狀的雞只，并且在雞群中呈現(xiàn)蔓延趨勢(shì)，初步懷疑為雞傳染性鼻炎。為確診病因，本試驗(yàn)進(jìn)行了病原菌的分離鑒定。在此過(guò)程中，我們同時(shí)分離到副雞禽桿菌(Avibacteriumparagallinarum，Apg)和禽鼻氣管鳥(niǎo)桿菌(Omithobacteriumrhinotracheale，ORT)。報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 參考菌株和陽(yáng)性血清 副雞禽桿菌、禽鼻氣管鳥(niǎo)桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株及副雞禽桿菌陽(yáng)性雞血清，均由本研究室保存；禽鼻氣管鳥(niǎo)桿菌陽(yáng)性分型血清由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)何誠(chéng)教授惠贈(zèng)。

1.1.2 病料 具有呼吸道癥狀病雞的雞頭，130日齡，來(lái)自北京某蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.1.3 主要試劑 TSA、TSB培養(yǎng)，均基購(gòu)自BD公司；2×TaqPCR Mix，購(gòu)自Genestar公司；16S rRNA引物，由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司合成；藥敏紙片，購(gòu)自O(shè)XOID公司。

1.1.4 主要儀器 168-1000XC酶標(biāo)儀，為美國(guó) BIO-RAD公司產(chǎn)品；DYY-6D電泳儀，為北京六一儀器廠(chǎng)產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 副雞禽桿菌與鼻氣管鳥(niǎo)桿菌的分離 75%酒精對(duì)送檢雞頭表面皮膚進(jìn)行消毒處理?？粝赂]部位烙鐵燒燙后，用滅菌處理的手術(shù)刀片劃開(kāi)，用無(wú)菌長(zhǎng)棉簽沾取眶下竇中干酪樣物質(zhì)，均勻劃線(xiàn)涂在含有5%雞血清的TSA平板中，將平板置于燭缸，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。次日，挑取單個(gè)代表性菌落進(jìn)行傳代，連續(xù)傳代3次，直至長(zhǎng)出大小形態(tài)均一的菌落。將分離到的菌落形態(tài)完全不同的2種細(xì)菌分別以適當(dāng)濃度涂于載玻片上，進(jìn)行固定與革蘭染色，在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察細(xì)菌的染色和形態(tài)特征。

1.2.2 2種分離菌的DNA提取及16S rRNA測(cè)序與比對(duì) 將純化后的副雞禽桿菌與鼻氣管鳥(niǎo)桿菌分別加入含10%血清及50 μg/mL NAD的TSB培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，參照天根生化科技(北京)有限公司DNA細(xì)菌提取試劑盒操作步驟，提取細(xì)菌DNA并測(cè)定濃度。參考陳小玲等[1]設(shè)計(jì)的細(xì)菌16S rRNA上下游引物序列，對(duì)2株分離菌進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 50 s，56 ℃ 50 s,72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶大小，并送華大基因科技服務(wù)有限公司進(jìn)行16S rRNA測(cè)序，將測(cè)序后的基因序列與NCBI上傳序列進(jìn)行比對(duì)。

1.2.3 2種分離菌的藥敏試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[2]中的操作步驟，應(yīng)用藥敏紙片擴(kuò)散法對(duì)分離的副雞禽桿菌和鼻氣管鳥(niǎo)桿菌菌株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)。

1.2.4 血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)副雞禽桿菌血清型 參照Page等[3-4]建立的HA-HI試驗(yàn)步驟，將副雞禽桿菌分離株在96孔微量凝集板中用滅菌PBS進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)⒃O(shè)陰性對(duì)照。然后每孔加入等體積的1%雞紅細(xì)胞懸液，輕微震蕩混勻后放37 ℃恒溫箱20 min，觀(guān)察并計(jì)算血凝效價(jià)HA。將實(shí)驗(yàn)室制備的抗副雞禽桿菌高價(jià)血清,按照不同血清型用滅菌PBS進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)靠?5 μL，設(shè)置陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔。除陰性對(duì)照孔外，每孔加入25 μL的4 HA抗原，作用30 min后，每孔加入25 μL的1%雞紅細(xì)胞懸液，輕微震蕩混勻后放37 ℃恒溫箱20 min，觀(guān)察試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.5 禽鼻氣管鳥(niǎo)桿菌抗原制備與瓊脂糖擴(kuò)散試驗(yàn) 將禽鼻氣管鳥(niǎo)桿菌分離株和標(biāo)準(zhǔn)株接種于5%雞血清TSA平板中，37 ℃溫箱培養(yǎng)48 h，用1 mL含有8.5%氯化鈉，0.3%福爾馬林的PBS將菌落洗下，放入2 mL EP管中，將菌液調(diào)整至OD600值為0.5～0.6，沸水浴煮60 min，菌液冷卻后15 000 g離心30 min，取上清，即為試驗(yàn)所用抗原。梅花樁打孔1.5%瓊脂糖平板，將陽(yáng)性分型血清25 μL加入中央孔，外周孔分別加入25 μL不同陽(yáng)性抗原及待測(cè)抗原，同時(shí)設(shè)立陰性血清對(duì)照，倒置放入37 ℃溫箱中培養(yǎng)，每24 h觀(guān)察1次沉淀線(xiàn)，連續(xù)觀(guān)察至第3天，并記錄結(jié)果。

1.2.6 分離菌攻毒試驗(yàn) 試驗(yàn)分為4組，每組10只雞。第1組為副雞禽桿菌攻毒組，挑取單菌落劃線(xiàn)TSA培養(yǎng)板，37 ℃培養(yǎng)15 h，次日用滅菌PBS洗下菌落，調(diào)至濃度為106CFU/mL，每只雞眶下竇接種0.2 mL；第2組為禽鼻氣管鳥(niǎo)桿菌攻毒組，細(xì)菌培養(yǎng)方法同上，調(diào)整菌液濃度為109CFU/mL，每只雞眶下竇接種0.2 mL；第3組為副雞禽桿菌攻毒與禽鼻氣管鳥(niǎo)桿菌共感染組，將副雞禽桿菌按106CFU/mL濃度每只接種0.2 mL后，再將禽鼻氣管鳥(niǎo)桿菌按109CFU/mL濃度每只接種0.2 mL；第4組為陰性對(duì)照組，每只雞眶下竇接種0.2 mL滅菌PBS。

2 結(jié)果

2.1 2種分離株16S rRNA測(cè)序與比對(duì) 對(duì)分離到的副雞禽桿菌與禽鼻氣管鳥(niǎo)桿菌進(jìn)行革蘭染色，油鏡下觀(guān)察均為革蘭陰性多形性短桿菌(見(jiàn)中插彩版圖1，圖2)。2個(gè)分離株進(jìn)行16S rRNA的PCR，產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖電泳，目的條帶大小在1 540 bp左右，與預(yù)期相符。將2個(gè)分離株測(cè)序后與GenBank中已上傳序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，2株菌分別為副雞禽桿菌(DW-1)與禽鼻氣管鳥(niǎo)桿菌(ORT-18)。16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果已經(jīng)分別上傳到GenBank中，登錄號(hào)分別為DW-1：MK855504.1，ORT-18：MN023014.1。

2.2 2種分離株藥敏試驗(yàn) 取分離的培養(yǎng)菌按常規(guī)紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示，2株分離菌對(duì)強(qiáng)力霉素、青霉素G等敏感，對(duì)鏈霉素及卡那霉素均不敏感，見(jiàn)表1。

2.3 血凝抑制檢測(cè)副雞禽桿菌血清型 血凝抑制試驗(yàn)鑒定副雞禽桿菌分離株的血清型，結(jié)果顯示，分離株與1 600倍稀釋后的A 型標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)(表2)，而與B型和C型副雞禽桿菌的特異性陽(yáng)性血清沒(méi)有結(jié)合反應(yīng)，說(shuō)明此分離株為A型副雞禽桿菌。

表1 2種細(xì)菌分離株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

表2 副雞禽桿菌的分型結(jié)果

2.4 瓊擴(kuò)試驗(yàn)檢測(cè)禽鼻氣管鳥(niǎo)桿菌血清型 經(jīng)過(guò)72 h濕盒孵育，觀(guān)察抗原孔與抗體孔中間有無(wú)沉淀線(xiàn)產(chǎn)生。結(jié)果顯示，此次的分離株只與A型陽(yáng)性血清產(chǎn)生沉淀線(xiàn)，因此判定分離的禽鼻氣管鳥(niǎo)桿菌血清型為A型。

2.5 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 副雞禽桿菌攻毒組的10只試驗(yàn)雞，在攻毒后24 h均出現(xiàn)呼吸道癥狀，表現(xiàn)出流鼻涕、打噴嚏、甩頭，頭面部出現(xiàn)一側(cè)或雙側(cè)腫脹。禽鼻氣管鳥(niǎo)桿菌攻毒組中，3只試驗(yàn)雞表現(xiàn)為流鼻液、呼吸有濕啰音等呼吸道癥狀。病雞剖檢可見(jiàn)氣囊炎、單側(cè)或雙側(cè)纖維素性化膿性肺炎。共感染組中，10只試驗(yàn)雞都出現(xiàn)嚴(yán)重的面部腫脹及大量鼻涕，并有眼瞼及結(jié)膜炎癥狀，雙眼因腫脹而閉合，病雞均出現(xiàn)精神委靡，羽毛松亂。痊愈時(shí)間滯后2～3 d。 試驗(yàn)雞病原菌重分離并進(jìn)行16S rRNA測(cè)序鑒定，結(jié)果顯示，共感染組的試驗(yàn)雞能夠分離到副雞禽桿菌和禽鼻氣管鳥(niǎo)桿菌。

3 討論

引起雞只眼瞼腫脹的病原有多種，最常見(jiàn)的是副雞禽桿菌引起的雞傳染性鼻炎。該病可引起嚴(yán)重的雞上呼吸道疾病[5-6]。臨床表現(xiàn)為打噴嚏、流鼻涕、鼻竇炎、結(jié)膜炎以及面部腫脹等，造成產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋率下降，肉雞淘汰率明顯升高，給養(yǎng)禽業(yè)造成很大經(jīng)濟(jì)損失[7-8]。如果控制不及時(shí)，易與其他疾病繼發(fā)感染[9-11]。目前，許多雞場(chǎng)仍?xún)A向于用抗生素控制雞傳染性鼻炎等細(xì)菌性傳染病。在生物安全條件較差的養(yǎng)雞場(chǎng)，雞舍通風(fēng)不良導(dǎo)致舍內(nèi)氨氣、硫化氫等刺激性氣體超標(biāo)，呼吸道黏膜受損，使得呼吸道傳染性疾病發(fā)生率大幅提高。

禽鼻氣管鳥(niǎo)桿菌病呈全球范圍內(nèi)流行，易感動(dòng)物種類(lèi)繁多，尤以禽類(lèi)最為易感。主要臨床癥狀為流鼻涕，呼吸紊亂等呼吸道癥狀，病雞生長(zhǎng)遲緩，采食量及肉增重減少，蛋雞產(chǎn)蛋量降低等。臨床剖檢中，病雞多見(jiàn)氣囊炎、單側(cè)或雙側(cè)纖維素性化膿性肺炎、胸膜炎等。該菌常與其他細(xì)菌或病毒混合感染家禽[12-14]，有文獻(xiàn)報(bào)道，在秘魯發(fā)生了副雞禽桿菌與禽鼻氣管鳥(niǎo)桿菌的混合感染[15]，本試驗(yàn)首次從國(guó)內(nèi)病例中同時(shí)分離到A型副雞禽桿菌與A型禽鼻氣管鳥(niǎo)桿菌。目前，禽鼻氣管鳥(niǎo)桿菌病原學(xué)、防控技術(shù)等研究還不夠深入，由于其血清型眾多，各分離株對(duì)抗生素的敏感性差異顯著，并且抗生素大量使用導(dǎo)致該菌耐藥性不斷增強(qiáng)。有必要深入研究該病原菌的致病機(jī)理，進(jìn)一步探究其防治策略。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，DW-1和ORT-18分離株之間存在差異。實(shí)踐生產(chǎn)中，可以通過(guò)病原菌分離培養(yǎng)、藥敏試驗(yàn)篩選共同有效的抗菌藥治療不同病原菌混合感染的病例。隨著抗生素禁用和限用等法律法規(guī)的不斷出臺(tái)，單純應(yīng)用抗生素治療細(xì)菌感染已經(jīng)越來(lái)越不可取，有效預(yù)防才是關(guān)鍵。因此，開(kāi)發(fā)具有更高免疫保護(hù)效力的針對(duì)性疫苗是選項(xiàng)之一，應(yīng)考慮針對(duì)感染癥狀相似但病原菌不同的細(xì)菌病開(kāi)發(fā)聯(lián)合疫苗。