福建省某規(guī)?；i場(chǎng)種公豬精液PRRSV檢測(cè)及ORF7基因序列分析

楊小燕，魏春華，戴愛(ài)玲，戴 巍，劉建奎

(龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 福建省家畜傳染病防治與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福建省生豬疫病防控工程技術(shù)研究中心，福建 龍巖 364000)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是一種以出現(xiàn)豬生產(chǎn)功能和呼吸系統(tǒng)疾病的由病毒引發(fā)的傳染病，常常呈現(xiàn)出厭食、高度發(fā)熱，常在懷孕的后期出現(xiàn)流產(chǎn)、生產(chǎn)死亡胎兒或木乃伊胎。該病自1987年在美國(guó)首次報(bào)道以來(lái)，迅速蔓延至幾乎所有的養(yǎng)豬國(guó)家，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-4]。

根據(jù)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的抗原性及其不同來(lái)源，將其分為Type 1(歐洲型，EU)和Type 2(北美洲型，NA)[5]。1996年郭寶清等證實(shí)PRRS在我國(guó)存在，隨后迅速傳播至全國(guó)各個(gè)省份，2006年我國(guó)多個(gè)省份的豬場(chǎng)暴發(fā)了高發(fā)病率和高死亡率的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Highly pathogenic PRRSV，HP-PRRSV)感染，2013年出現(xiàn)了與美國(guó)毒株NADC30高度同源的NADC30-like PRRSV，進(jìn)一步加劇了PRRSV的復(fù)雜多樣性[3-5]。根據(jù)Shi 等[6]建立的分類標(biāo)準(zhǔn)，PRRSV 可分為 9個(gè)譜系(Lineage)。目前，我國(guó)田間流行的PRRSV毒株主要分為4類，HP-PRRSV處于譜系 8.7，NADC30-like PRRSV 處于譜系 1，QYYZ-like PRRSV處于譜系 3和VR-2332 like PRRSV處于譜系 5.1[7-8]。

為了解福建地區(qū)某一規(guī)?；i場(chǎng)種公豬所感染的PRRSV的流行特點(diǎn)，本試驗(yàn)隨機(jī)采集(10%比例)種公豬精液進(jìn)行PRRSV檢測(cè)，證實(shí)該豬場(chǎng)流行的毒株為譜系3的毒株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源 在福建省某規(guī)模化豬場(chǎng)的公豬舍內(nèi)按照10%的比例隨機(jī)挑選17頭公豬，編號(hào)為G1～G17，采集其精液作為樣本，并于-80 ℃冰箱保存。

1.1.2 主要儀器與試劑 M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、TaqDNA聚合酶和pMD19-T，均購(gòu)自TaKaRa公司；RNA simple Total RNA Kit、Universal DNA Purification Kit和感受態(tài)細(xì)胞DH5α，均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.3 PCR引物設(shè)計(jì) 參考文獻(xiàn)[9]設(shè)計(jì)引物，用于擴(kuò)增ORF7基因序列。目的片斷大小為570 bp。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取及RT-PCR 將精液反復(fù)凍融3次后按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取精液中的RNA，按照說(shuō)明書制備其cDNA，以其為模板進(jìn)行ORF7基因的PCR擴(kuò)增，最終得到的PCR產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.2 目的基因的克隆與序列分析 將目的基因膠回收純化后克隆至pMD19-T載體并轉(zhuǎn)化到Trans T1感受態(tài)細(xì)胞中，涂板后置于37 ℃培養(yǎng)箱12 h過(guò)夜，鑒定為陽(yáng)性的重組菌送至北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測(cè)序，利用MEGA6.0和DNASTAR軟件對(duì)PRRSVORF7基因進(jìn)行遺傳變異分析，本試驗(yàn)序列比對(duì)所用的毒株信息見(jiàn)表1。

表1 本試驗(yàn)使用的PRRSV毒株信息

2 結(jié)果

2.1 PRRSVORF7 RT- PCR擴(kuò)增 17份樣品的RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，有9份樣品在約570 bp位置出現(xiàn)目的條帶，大小符合預(yù)期(圖1)。

2.2 序列分析 測(cè)序結(jié)果表明，該豬場(chǎng)9份的PRRSVORF7基因之間的同源性為100%，與譜系3中GM2、QYYZ和FJFS的同源性最高，為92.7%～93.8%；與JXA1、HuN4等HP-PRRSV毒株同源性為90.3%～91.9%，與VR2332和MLV的同源性為91.9%～92.5%；而與NADC30的最低,為89.5%(圖2)。

圖1 ORF 7 基因RT -PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification of ORF 7 gene by RT-PCRM：DNA Marker DL-2 000； -：陰性對(duì)照； 1～17：G1～G17M：DNA Marker DL-2 000; -：Negative control; 1～17：G1～G17

遺傳進(jìn)化樹結(jié)果表明，所測(cè)毒株與QYYZ、GM2和FJFS等譜系3毒株處于同一進(jìn)化分支，親緣關(guān)系較近，而與VR2332、CH-1a、NADC30、JXA1和HuN4處于不同的進(jìn)化分支，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖3)。

圖2 9株P(guān)RRSV ORF 7基因序列同源性比對(duì)Fig. 2 Comparison of nucleotide sequences of ORF 7 of nine PRRSV strains with isolates

圖3 PRRSV ORF 7基因遺傳進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of the ORF 7 of PRRSV strains

3 討論

PRRS在近年來(lái)不斷給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)很大的沖擊，尤其是引起大規(guī)模的死胎、流產(chǎn)現(xiàn)象，這給豬場(chǎng)帶來(lái)非常大的經(jīng)濟(jì)損失，并且PRRSV變異很快，這就使得防控方面很難做到位。福建省某規(guī)?；i場(chǎng)2018年1～3月以來(lái)，不斷出現(xiàn)母豬產(chǎn)死胎、木乃伊胎、流產(chǎn)等情況，臨診初步懷疑為豬繁殖與呼吸綜合征，送檢的死胎中檢測(cè)出有PRRSV，但是送檢母豬組織中并未檢測(cè)出PRRSV。研究表明，公豬精液是多種病原傳播的良好媒介，對(duì)于疫病的傳播起著重要作用，PRRSV感染種公豬后可在其精液中檢測(cè)到病毒[12]，為了從根本上杜絕疫病的繼續(xù)發(fā)生，以及查出疫病傳播源頭，因此從種公豬角度出發(fā)，按照10%的比例，隨機(jī)抽取17份公豬精液樣品進(jìn)行PRRSV檢測(cè)，結(jié)果表明，9份精液PRRSV呈陽(yáng)性，樣品陽(yáng)性率為52.7%，表明存在種公豬通過(guò)精液向母豬傳播PRRSV的風(fēng)險(xiǎn)。因此，豬場(chǎng)應(yīng)加強(qiáng)種豬精液檢測(cè)，及時(shí)淘汰攜帶PRRSV的種公豬，及時(shí)切斷傳染源控制PRRS的傳播和流行。

從基因序列分析同源性比對(duì)結(jié)果中可以看出，該場(chǎng)公豬精液9份陽(yáng)性樣品中PRRSV的ORF7基因之間的同源性為100%，與譜系3的QYYZ、GM2和FJFS的同源性最高，為92.7%～93.8%；而與JXA1、HuN4等HP-PRRSV代表毒株，VR2332和MLV弱毒疫苗株等經(jīng)典毒株，NADC30、FJZ03等NADC30-like毒株的同源性較低，分別為90.3%～91.9%、91.9%～92.5%和89.5%。遺傳進(jìn)化樹結(jié)果表明，所測(cè)毒株與QYYZ、GM2、FJFS等譜系3毒株親緣關(guān)系較近，處于同一分支，而與JXA1、HuN4、VR2332、CH-1a及NADC30等代表毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。因此，該豬場(chǎng)所測(cè)毒株為新流行的譜系3毒株。

目前減毒活疫苗已成為控制PRRS的重要手段，但是由于PRRSV易變異的特性，使得其在防控方面非常的復(fù)雜，雖然PRRSV-MLV疫苗可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)，但并不能對(duì)所有毒株起到有效的交叉保護(hù)作用[10-11]。譜系3的毒株與現(xiàn)有的商品化疫苗株處于不同遺傳分支，現(xiàn)有的弱毒疫苗是否能對(duì)其起到良好的免疫保護(hù)作用需要進(jìn)一步研究。