鴨甲肝病毒抗體的間接ELISA檢測方法的建立

殷 茵，張琰杰，閆艷新，任慧英，劉文華

(青島農業大學動物醫學院，山東 青島 266109)

鴨肝炎病毒(Duck hepatitis virus，DHV)可引起雛鴨急性高度致死性感染，尤其是3周齡內最易感，死亡率高達80%，給養鴨業造成了重大經濟損失[1]。DHV可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三個血清型，其中Ⅰ型DHV屬于小RNA病毒科禽肝病毒屬的鴨甲肝病毒(Duck hepatitis A virus，DHAV)，Ⅱ型DHV和III型DHV屬于星狀病毒科禽星狀病毒屬鴨星狀病毒(Duck astrovirus，DAstV)[2]。其中DHAV又根據基因同源性差異分為3個基因型，分別為1型DHAV、2型DHAV和3型DHAV[3]。目前臨床鴨肝炎主要是由1型和3型DHAV引起[4]。我國臨床上針對DHAV商品化的生物制品主要是1型DHAV弱毒苗，3型DHAV 疫苗還沒有得到正式審批。由于3型DHAV的廣泛存在，大部分種鴨場也會利用3型DHAV臨床分離株制備自家滅活苗與1型DHAV疫苗同時免疫。商品鴨場為了預防鴨肝炎，通常在3～5日齡進行卵黃抗體注射，目前臨床應用的也多是1型+3型的雙聯抗體，所以針對DHAV建立一種快速、敏感、特異的抗體檢測方法是非常必要的。雖然有針對鴨肝炎病毒的商品化ELISA試劑盒，但價格昂貴。由于DHAV顆粒太小，不易得到純化病毒，而以全病毒作為包被抗原對病毒的純化要求又較高，本試驗擬以表達蛋白作為包被抗原，建立一種檢測DHAV抗體的間接ELISA方法，為臨床種鴨免疫效果的判定及DHAV卵黃抗體效價測定提供方便。

1 材料

表達載體pCold TF,為TaKaRa公司產品；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑,為Sigma公司產品；山羊抗鴨IgG酶標二抗,為美國KPL公司產品；鼠抗His標簽單克隆抗體,為Top Science公司產品；3型DHAV雙抗原夾心ELISA試劑盒,為上海嵐派生物科技有限公司產品；其他試劑，均為Solarbio公司產品；試驗用各類病毒陽性血清，為山東省農業科學院家禽研究所黃兵研究員惠贈。

2 間接ELISA方法的建立

2. 1 包被抗原和抗體最佳工作濃度確定 將實驗室前期表達鑒定的DHAV的VP3蛋白通過切膠回收法進行純化[5]。將純化蛋白用包被液分別進行1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000的倍比稀釋，加入酶標板中4 ℃包被過夜。PBST洗滌5次，300 μL/孔加入封閉液，37 ℃孵育1.5 h；洗滌后再100 μL/孔分別加入1∶50、1∶100、1∶200的陽性和陰性血清，每個稀釋度做復孔；洗滌后按100 μL/孔分別加入0.2 μg/mL的山羊抗鴨IgG-HRP，37 ℃孵育1 h；洗滌后每孔加100 μL TMB顯色液，室溫避光顯色15 min，每孔加50 μL 2 mol/L的H2SO4終止反應，立即在酶標儀上測定OD450值。根據陽性和陰性血清的OD450值，選取P/N最大時對應的包被抗原和血清稀釋度作為最佳稀釋倍數[6]。

2.2 酶標二抗最佳工作濃度確定 根據山羊抗鴨IgG-HRP酶標抗體說明書提供的工作濃度范圍分別做1∶100、1∶200、1∶300、1∶400和1∶500倍稀釋，在已經確定的最佳條件下進行ELISA，比較各組陰陽性血清的OD450值和P/N值，確定酶標二抗最佳稀釋倍數[7-8]。

2.4 特異性試驗 用VP3重組蛋白建立的間接ELISA方法分別檢測鴨流感、鴨瘟、黃病毒、鴨甲肝病毒1型、鴨甲肝病毒3型、鴨甲肝病毒1+3型以及陰性血清進行交叉反應性測定，每個樣本重復2次。

2.5 敏感性試驗 對3份不同的DHAV血清，從1∶100開始進行2倍倍比稀釋，用建立的間接ELISA方法檢測，以能檢測出陽性的最大血清稀釋度作為樣品的最低檢出量。

2.6 重復性試驗 板內重復性試驗：用同一批次純化的VP3蛋白包被酶標板，應用建立的間接ELISA條件對3份不同的陽性血清進行檢測，每份樣品做5個平行孔，對結果進行統計學分析。板間重復性試驗:用同一批次純化的VP3蛋白但不同時間包被的酶標板，應用建立的間接ELISA方法對3份不同陽性血清進行檢測，每份樣品做5個平行孔，結果進行統計學分析。統計學分析方法：計算同一份血清變異系數CV%，以檢驗板內和板間檢測樣品的重復性。

2.7 間接ELISA與雙抗原夾心ELISA符合率試驗 取40份免疫鴨血清分別用建立的間接ELISA方法和商品化的雙抗原夾心ELISA試劑盒進行抗體檢測，比較兩者診斷的敏感性(即陽性檢出率)、特異性(2種檢測方法陰性率的比值)、符合率(2種檢測方法陰性和陽性符合份數之和與總份數的比值)[8]。

3 結果

3.1 VP3重組蛋白的純化 3型DHAV的VP3蛋白的純化結果見圖1。由圖1可知，切膠純化后獲得了與預期大小一致的78 kD的VP3重組表達蛋白，經蛋白濃度測定儀測定濃度為319 μg/mL。

圖1 純化VP3蛋白的SDS-PAGE結果Fig.1 SDS-PAGE results of purified VP3 proteinM： 標準蛋白分子質量； 1： 純化的VP3蛋白M： Protein standards； 1： Purified VP3 protein

3.2 包被抗原和抗體最佳工作濃度測定結果 抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的測定結果見表1。由表1可見，VP3蛋白包被濃度為0.159 5 μg/mL，血清稀釋1∶200倍時，陽性血清OD450值(P)為1.144，陰性血清OD450值(N)為0.355，P/N值最大。因此選擇最佳抗原包被濃度為0.159 5 μg/mL，血清稀釋度為1∶200。

表1 包被抗原和抗體最佳工作濃度測定結果Table 1 Results of determination of optimal working concentration of coated antigen and antibody

3.3 酶標二抗最佳工作濃度測定 酶標二抗各稀釋倍數結果如表2所示，當酶標二抗稀釋至1∶500時，P/N比值最大，確定其最佳工作濃度為0.2 μg/mL。

表2 最佳酶標抗體工作濃度的確定Table 2 Determination of the optimal working concentration of enzyme-labeled antibody

3.5 特異性試驗 按照建立的間接ELISA方法進行特異性交叉試驗，檢測結果見表4。結果顯示VP3蛋白能夠與1型DHAV、3型DHAV以及1+3型DHAV陽性血清表現為陽性反應，說明該方法可同時檢測1型與3型DHAV血清抗體。與鴨瘟病毒、鴨流感病毒和鴨黃病毒的陽性血清沒有交叉反應，說明該方法的特異性良好。

表3 未免疫鴨血清的DHAV抗體檢測結果Table 3 DHAV antibody test results in unimmunized duck serum

表4 交叉反應性檢測結果Table 4 Cross-reactivity test results

3.6 敏感性試驗 檢測結果顯示5份血清1∶800稀釋的OD450值均大于臨界值0.405，間接ELISA方法的靈敏度為1∶800(表5)。

表5 間接ELISA方法敏感性檢測Table 5 Indirect ELISA method sensitivity detection

3.7 重復性試驗 按照建立的間接ELISA方法檢測3份血清，板內重復性試驗結果如表6所示，板內變異系數在4.95%～6.57%，均小于10%；板間重復性試驗結果如表7所示，板間變異系數在5.73%～8.30%，均小于10%。說明建立的ELISA方法具有較好的板內重復性和板間重復性。

表6 板內變異系數的測定Table 6 Determination of the coefficient of variation in the plate

表7 板間變異系數的測定Table 7 Determination of coefficient of variation between plates

3.8 間接ELISA與雙抗原夾心ELISA符合率試驗 用商品化的雙抗原夾心ELISA試劑盒與本試驗建立的間接ELISA方法同時檢測40份臨床免疫鴨血清，檢測結果見表8。由表8可知，商品化的雙抗原夾心ELISA試劑盒與本試驗建立的間接ELISA檢測陽性率分別為65%(26/40)和62.5%(25/40)。有1份雙抗原夾心ELISA檢測陰性血清，間接ELISA檢測呈陽性；有2份雙抗原夾心ELISA檢測陽性血清，間接ELISA檢測呈陰性。以雙抗原夾心ELISA為參考，間接ELISA的診斷敏感性和診斷特異性分別為92.3%(24/26)和92.9%(13/14)。所以本試驗建立的間接ELISA與雙抗原夾心ELISA的符合率為92.5%。

表8 間接ELISA與雙抗原夾心ELISA的符合率Table 8 Consistency of indirect ELISA and dual antigen sandwich ELISA

4 討論

全病毒包含該病毒的所有抗原位點，而表達蛋白僅包含部分抗原位點[9]，因此在建立間接ELISA方法時將全病毒作為包被抗原比包被蛋白效果要好。對鴨肝炎病毒來說，由于病毒粒子太小，很難達到理想的純化效果，因而常規的瓊脂擴散試驗不適于DHAV的抗體檢測，ELISA方法靈敏度較高，但同樣存在包被抗原制備困難的問題，所以迫切需要尋找能夠代替全病毒的抗原。重組蛋白因其容易表達和純化，并具有良好免疫反應的特點成為一種最佳選擇。目前，以重組蛋白作為包被抗原的ELISA方法已得到廣泛應用[10-11]，但報道的方法基本是用1型DHAV的VP3蛋白[12-13]，未見有將3型DHAV的VP3蛋白用于建立間接ELISA檢測鴨甲肝病毒抗體的報道。特異性試驗結果表明，本試驗表達的VP3蛋白能同時跟1型和3型DHAV陽性血清反應，說明本試驗建立的間接ELISA方法能同時檢測1型和3型DHAV抗體。

理論上講，間接ELISA可出現陽性和陰性2種結果，但實際檢測中會有少量樣本檢測值位于陰、陽性的分界處，難于準確判斷。科學合理的判定臨界值對保證試驗結果的準確性至關重要。本試驗應用40份健康鴨陰性血清進行了檢測與分析，得出陰、陽性血清的臨界值為0.405。因血清來源和數量有限不能夠代表全部健康鴨的血象特征，因此本試驗設定的臨界值還需要在今后大量的應用中進一步完善。根據建立的ELISA方法及最佳反應條件，確定該方法的特異性，結果表明，本試驗建立的間接ELISA方法可用于鴨肝炎病毒抗體水平的檢測。

本試驗以3型DHAV的VP3表達蛋白作為包被抗原建立的檢測鴨甲肝病毒抗體的間接ELISA方法具有較好的特異性、敏感性和重復性。與商品化的雙抗原夾心ELISA方法的符合率為92.5%。