犬瘟熱病毒受體SLAM TaqMan熒光定量PCR方法的建立

王介淞，林佳旭，王鑫磊，黃 娟

(青島農業大學動物醫學院 山東省獸藥診斷試劑工程技術研究中心，山東 青島 266109)

犬瘟熱 (Canine distemper，CD) 是由副黏病毒科(Paramyxoviridae) 麻疹病毒屬(Morbillivirus) 的犬瘟熱病毒(Canine distemper virus, CDV) 感染引起的多種動物共患傳染病[1]。其中犬科、鼬科、貓科等動物是犬瘟熱的易感宿主，感染后死亡率為 30%～80%[2]。近年來，隨著我國毛皮市場日益壯大，水貂、狐貍和貉的養殖行業蒸蒸日上，密度的擴大加上飼養條件的不規范，使得犬瘟熱在養殖場內廣泛流行，給養殖戶造成巨大的經濟損失[3]。

病毒研究的熱點之一為病毒受體的研究，受體在病毒感染細胞過程中起很重要旳作用[4-6]。細胞表面受體決定了病毒的組織嗜性和感染宿主范圍，因此，CDV的跨種間傳播現象與其感染宿主的細胞受體的表達有著密切關系[7]。犬瘟熱病毒的表面糖蛋白(血凝素蛋白、融合蛋白)與受體相互識別、吸附，導致CDV侵染宿主細胞[8-9]。信號淋巴細胞激活分子(Signaling lymphocyte activation molecule, SLAM，又稱CD150)是犬瘟熱病毒的主要受體，在犬瘟熱病毒侵染宿主細胞的過程中發揮著重要的作用[10]。研究CDV感染不同階段SLAM的動態分布，有助于我們進一步闡明CDV的致病機制。但是，目前尚無文獻報道SLAM熒光定量PCR(Flurogenic quantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR)檢測方法。

本試驗采用TaqMan探針技術建立了檢測水貂淋巴細胞SLAM基因的實時熒光定量PCR方法，為下一步研究CDV感染動物不同階段SLAM的動態分布提供有效的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒及質粒 犬瘟熱病毒、克隆了水貂SLAM基因的重組質粒pMD18-T-SLAM均由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑和儀器 PremixExTaqTM(Probe qPCR)、 PremixExTaqPrimeScript RT reagent Kit(Perfect Real Time)試劑盒、RNAiso plus裂解液，均購自TaKaRa公司；其他試劑均為國產或進口分析純。主要儀器有Light Cycler 96 SW PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統。

1.1.3 試驗動物 60日齡的健康水貂，來自青島某水貂養殖場。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計與合成 根據GenBank中已發表的水貂SLAM基因核酸序列(FJ626692)，利用Primer5設計1對特異性引物。SLAM基因的引物序列為：F：5′-TCCAGAGGCATAAGTAAG-3′;R:5′-TCCAGATGAAAGGTATAGC-3′；探針序列為：5′-(FAM)CGTCCTTGTCACCAGAGCAGA(Eclipse)-3′。引物和探針由TaKaRa公司合成，熒光標記選擇FAM作為報告發光基團，NFQ為淬滅基團，擴增目的片段長度為158 bp。

1.2.2 標準品質?？截悢档挠嬎?以pMD18-T-SLAM質粒作為標準品，用紫外分光光度計測定未稀釋標準品質粒的OD260值及OD280值，計算標準品質粒的質量濃度(ng/μL)和拷貝數。對其依次進行10-2、10-3、10-4、…、10-12倍梯度稀釋，-20 ℃保存備用。

1.2.3SLAMTaqMan熒光定量PCR反應體系和條件的優化

1.2.3.1 引物和探針濃度的優化 以10-2倍稀釋的標準品作為模板，引物和探針經過稀釋配比成5、10、15、20、25、30 μmol/L的濃度，用矩陣法來篩選構建的SLAM基因熒光定量PCR最佳的引物和探針的使用量。

1.2.3.2 循環條件的優化 為了獲得較好的熒光增幅和擴增效率，對TaqMan實時熒光定量PCR循環次數進行篩選；退火溫度選擇從55 ℃逐漸遞增到60 ℃，篩選出最佳的反應條件。

1.2.3.3 熒光定量PCR產物電泳 以優化好的反應條件進行熒光定量PCR，產物于1%瓊脂糖凝膠上電泳，拍照記錄結果。

1.2.4 標準曲線的構建 以10-2、10-3、10-4、…、10-7倍稀釋的標準品做模板，用優化后的反應體系和程序進行TaqMan實時熒光定量PCR，循環閾值作為縱坐標，質粒拷貝數的常用對數(lgC)作為橫坐標，繪制標準曲線，計算出其標準線性回歸方程，并計算出R值。

1.2.5 敏感性試驗 以10倍倍比稀釋的標準品為模板，用相應的引物、探針及優化后的條件進行實時熒光定量PCR擴增，并以雙蒸水代替模板作為陰性對照，記錄數據。

1.2.7 TaqMan熒光定量PCR方法對臨床樣品的檢測 取水貂場60日齡的健康水貂外周血分離淋巴細胞，鋪96孔板，并用200 TCID50CDV感染，分別在感染前(0 h)和感染后12 h提取CDV感染組和細胞對照組細胞總RNA，用反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA，用構建好的TaqMan熒光定量PCR進行檢測并記錄數據。

2 結果

2.1SLAMTaqMan熒光定量PCR反應體系和條件的優化 經過優化，PCR反應總體系為25 μL，其中PremixExTaqTM(Probe qPCR)12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，探針1 μL，質粒模板2 μL，補雙蒸水至25 μL，反應程序為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s， 55 ℃退火10 s，72 ℃收集熒光20 s，40個循環。此條件能獲得良好的擴增曲線(圖1)，PCR產物呈現單一條帶，大小符合預期(158 bp)(圖2)。

2.2SLAMTaqMan熒光定量PCR標準曲線的建立 分別以10-2～10-7倍稀釋的標準品進行熒光定量PCR見封三彩版圖3，建立的標準曲線見圖4。SLAM基因的擴增效率為97.8%，R2為0.998 2，表明建立的標準曲線具有良好的線性關系，各個稀釋度相關性好，誤差較小；循環閾值(y)與質?？截悢档某Ｓ脤?lgC)的關系式為：y=-2.725 7x+37.212。

圖1 水貂SLAM TaqMan熒光定量PCR擴增曲線Fig.1 TaqMan FQ-PCR curve for mink SLAM gene

圖2 水貂SLAM TaqMan熒光定量PCR產物電泳Fig.2 Electrophoresis of TaqMan FQ-PCR product of mink SLAM geneM:100 bp DNA Laddar Marker； 1:PCR產物； 2:陰性對照M:100 bp DNA Laddar Marker； 1:PCR product； 2:Negative control

圖4 犬瘟熱病毒受體SLAM TaqMan熒光定量PCR檢測方法的標準曲線Fig.4 Standard curve of FQ-PCR for CDV receptor SLAM detection

2.3SLAMTaqMan 熒光定量PCR方法的敏感性試驗 經計算，標準品的起始濃度為2.45×109拷貝/μL，以10倍倍比稀釋的標準品進行TaqMan熒光定量PCR,當標準品的拷貝數為2.45 拷貝/μL時，才有擴增曲線出現，而2.45×10-1拷貝/μL及空白對照無擴增曲線(見封三彩版圖5)，因為模板加入量為2 μL，所以該方法的最低檢出限度為4.9個拷貝。

2.4SLAMTaqMan 熒光定量PCR方法的重復性試驗

2.4.1 組內重復試驗 以同一稀釋度的標準品質粒為模板，一次性進行3個樣品的重復性試驗，結果Cq值分別是21.89、21.87、21.88(見封三彩版圖6)。

2.4.2 組間重復試驗 以10-2倍、10-3倍、10-4倍稀釋的標準品，分別進行6次試驗，結果Cq值變異系數均小于1%(見表1)，表明檢測方法具有較好的組間重復性。

2.5SLAMTaqMan熒光定量PCR方法對臨床樣品的檢測 對體外培養的淋巴細胞在CDV感染前后進行熒光定量PCR檢測，結果顯示該方法能夠檢測出外周血淋巴細胞中的SLAM基因，CDV感染后SLAM基因表達量較感染前有所上升，細胞對照組SLAM基因表達量基本保持穩定趨勢(見表2)。

3 討論

表1 水貂SLAM基因實時熒光定量PCR組間重復試驗Table 1 Inter group repetition of TaqMan FQ-PCR based on SLAM

表2 SLAM TaqMan熒光定量PCR方法對體外淋巴細胞的檢測Table 2 Detection of SLAM in peripheral blood lymphocyte by TaqMan FQ-PCR assay

SLAM是麻疹病毒屬病毒的共同受體，據報道，人麻疹病毒感染機體后并不會引起受體SLAM的下調[11]。為了更好的了解犬瘟熱病毒致病機制，需要對其宿主SLAM受體進行多方面的研究，包括動物在發病前和發病后體內SLAM受體的表達情況都需要進一步研究。目前檢測目的基因表達的常見方法有常規PCR、免疫組化等[5，12-13]。由于普通PCR只能檢測樣品中是否含有目的基因，但是不能準確分析樣品中目的基因含量的多少；免疫組化利用抗原抗體能夠特異性結合的原理，能夠對某些成分進行定位，但不能準確定量[5]。本試驗構建了相比普通PCR更能準確分析SLAM受體含量的實時熒光定量PCR方法，利用引物和探針相互作用的原理，能夠特異性檢測SLAM基因的表達情況，表達量的多少根據儀器的Ct(或Cq)值，代入構建好的標準曲線方程式中，在1～2 h以內就能完成檢測，省時省力。

犬瘟熱病毒受體SLAM熒光定量方法的構建，為研究SLAM與犬瘟熱病毒的相互作用，闡明犬瘟熱致病機制提供了有力的手段。目前已有報道受體SLAM在感染CDV后的動物體內的不同組織和器官的分布[5]，但是至今尚未有研究報道在犬瘟熱病毒感染動物后的不同發病時期的表達量的動態變化，通過研究犬瘟熱發病不同階段SLAM蛋白和CDV N蛋白表達量的動態變化和聯系，為犬瘟熱病的臨床觀察和預后治療提供了新的思路和途徑。本方法的建立也可以為以后研究犬瘟熱病毒與其他受體之間的相互作用提供借鑒。當然，雖然FQ-PCR技術能夠定量分析不同時期患病動物淋巴細胞上SLAM受體的mRNA轉錄情況，但還需與其他方法(如免疫組化結果)相互佐證，綜合分析SLAM的基因轉錄和蛋白表達情況。