2株膠東地區Ⅰ群禽腺病毒分離株的致病性試驗

董振杰 , 劉 東 , 魏建平 , 佘銳萍

[1.福喜(威海)農牧發展有限公司 , 山東 威海 452600 ； 2.青島易邦生物工程有限公司，山東 青島 266000 ； 3.大連成三牧業股份有限公司，遼寧 大連 116300 ； 4.中國農業大學動物醫學院，北京 海淀 100193]

Ⅰ群禽腺病毒(Fowl adenovirus, FAdV)屬于禽腺病毒科禽腺病毒屬，有12個血清型，其中FAdV-8b血清型可引起雞包涵體肝炎(IBH)， FAdV-4血清型可引起雞心包積水綜合征(HHS)[1]。近年來，這2種疾病在世界各地(例如美國[2]、韓國[3]、日本[4]和中國[5])均有暴發，已經對肉雞和肉種雞的養殖造成了較嚴重的經濟損失。2013年，膠東地區發現了1例包涵體肝炎的病例，導致10～15日齡商品代雛雞出現死亡，死亡率約為2%～10%；2015年，膠東地區發現了1例雞心包積水綜合征的病例，導致31周齡的肉種雞出現死亡，死亡率為14.05%。采集上述2個病例的肝臟樣品進行病毒分離鑒定，發現病原分別為FAdV-8b和FAdV-4，分別命名為FXWH-8b株和FXWH-4株。

以2株分離株為研究對象，通過對15日齡SPF雞進行攻毒試驗，對病毒的毒力和致病性進行研究，旨在明確FXWH-8b株和FXWH-4株感染發病后的臨床癥狀、剖檢病變、病理組織學變化及病毒在各組織器官的分布情況，為闡明FXWH-8b株和FXWH-4株的致病機理及防制提供理論依據。

1 材料

15日齡SPF雞，購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司；稀釋復壯后(TCID50108.0)FXWH-8b株和FXWH-4株的病毒液各10 mL，來自青島易邦生物工程有限公司；TaqDNA 聚合酶(5 U/μL)、蛋白酶K，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；甲醛、梯度乙醇和二甲苯(級別為化學純)、伊紅染液、蘇木素染色液，均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；FAdV單抗(3D7)，購自國家獸用藥品工程技術研究中心。

2 方法

2.1 攻毒試驗 60只15日齡的SPF雛雞隨機分成3組，每組20只。分別為FXWH-8b株攻毒組、FXWH-4株攻毒組、空白對照組。通過腿部肌肉注射接種，攻毒組病毒注射劑量均為0.2 mL/只，對照組每只注射0.2 mL生理鹽水。各組雞只分別飼養在不同的隔離器中，逐日觀察癥狀并記錄，觀察期為3 d。觀察完成后，所有雞只安樂死。

對各組雞只進行剖檢觀察，并做好記錄，采取各組雞只的腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、十二指腸、空腸、盲腸、法氏囊、腺胃、胰腺、胸腺、氣管等組織，凍存，作為PCR檢測的樣品；另取各組3～4只發病的活雞和死雞的上述組織，用10%的中性甲醛溶液固定24 h。

2.2 病理組織學觀察 采用常規石蠟切片的方法制作切片，通過蘇木精-伊紅(H.E.)染色，中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察病變并記錄。

2.3 PCR檢測 用Meulemans G發表的通用引物，檢測病毒在各組織中的分布情況。

2.4 免疫組化分析 用常規免疫組化方法進行試驗，在普通光學顯微鏡下觀察結果。

3 結果

3.1 臨床癥狀 FXWH-8b株攻毒組：攻毒24 h后，有5只雞開始出現明顯的臨床癥狀，表現精神沉郁，羽毛蓬松，采食量下降，頭部皮膚及眼部發紺，排出黃綠色稀糞，畏寒怕冷，對外界刺激反應遲鈍甚至無反應；72 h后，有8只雞死亡，剩余的12只雞均出現明顯臨床癥狀。FXWH-4株攻毒組：攻毒24 h 后，有12只雞開始出現明顯臨床癥狀，表現精神沉郁，羽毛蓬松，采食量下降，頭及眼部發紺，排出黃綠色稀糞，畏寒怕冷，對外界刺激反應遲鈍甚至無反應；48 h后20只雞全部死亡。對照組：在72 h 內無任何明顯臨床癥狀。

3.2 剖檢變化 FXWH-8b株和FXWH-4株攻毒后剖檢病理變化見表1。

表1 分離株攻毒后剖檢病理變化Table 1 Pathological changes of the isolates after virus challenge

3.3 病理組織學觀察 FXWH-8b株攻毒72 h后，死雞和活雞病理組織學觀察均顯示肝臟細胞呈彌散性脂肪變性(見中插彩版圖1)，可見灶性壞死，核內包涵體不明確；脾臟髓竇內含鐵血黃素沉淀；肺臟嚴重淤血；腎臟出血，腎小管上皮細胞脫落；十二指腸黏膜上皮細胞輕微脫落；空腸黏膜上皮細胞輕微脫落；盲腸黏膜上皮細胞輕微脫落；腺胃黏膜上皮細胞輕微脫落；法氏囊淋巴濾泡內少量淋巴細胞遺失。

FXWH-4株攻毒48 h后，死雞的病理組織學觀察結果顯示，肝臟病變同上(見中插彩版圖1)；脾臟白髓淋巴濾泡內淋巴細胞遺失；肺臟嚴重淤血；腎臟腎小管上皮細胞脫落；十二指腸黏膜上皮細胞脫落；空腸黏膜上皮細胞脫落；盲腸、腺胃黏膜上皮細胞壞死，固有層淤血；法氏囊黏膜上皮細胞嚴重脫落、淋巴濾泡內淋巴細胞遺失。

空白對照組注射生理鹽水72 h后，活雞病理組織學觀察結果顯示，在肝臟、肺臟、腺胃和盲腸有輕微的組織病理學變化。

3.3 PCR檢測 FXWH-8b株和FXWH-4株攻毒組SPF雞的腦、胸腺、氣管、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腺胃、胰腺、十二指腸、空腸、盲腸和法氏囊組織樣品中，病毒PCR檢測均呈陽性；其中，在雞的肝臟、肺臟、腎臟、腺胃、空腸和盲腸樣品中的PCR檢測陽性率均為100%。結果見表2。

3.4 免疫組化分析 FXWH-8b株病毒抗原僅在肝臟組織樣品中檢測呈陽性；FXWH-4株病毒抗原在肝臟、腎臟、十二指腸和空腸組織樣品中檢測均呈陽性，陽性信號強度是：肝臟>十二指腸>空腸和腎臟。對照組樣品檢測均呈陰性。結果見表3、中插彩版圖2。

表2 組織中的病毒DNA PCR檢測結果Table 2 PCR results of virus DNA in tissues (只)

表3 免疫組化染色結果Table 3 Immunohistochemical staining results

4 討論

臨床癥狀觀察顯示，FXWH-8b株和FXWH-4株均能在攻毒后48 h內引起15日齡的SPF試驗雞發病，呈現較明顯的臨床癥狀。FXWH-8b株攻毒后48 h沒有雞只死亡，72 h時引起40%的試驗雞死亡；FXWH-4株在48 h引起100%的試驗雞死亡。這可能是由于病毒以注射方式感染時，毒株會表現很強的致病性，短時間內造成機體損傷乃至死亡，呈現急性感染死亡的癥狀[1]；另一個原因可能是攻毒劑量過大，故建議其他研究者將感染途徑改為以滴口方式通過消化道感染，攻毒劑量應多次預試驗后確定。從死亡率來看，2株分離株的毒力都比較強，但是FXWH-4株的毒力遠強于FXWH-8b株，這與劉東等[7]研究認為血清型FAdV-4毒力較強，本身能引起易感雞群的發病的結論一致。

病理組織觀察結果顯示，在2株Ⅰ群禽腺病毒分離株攻毒后雞的組織切片中，均未觀察到核內包涵體的存在，其原因可能是由于FXWH-4株在攻毒后48 h雞只全部死亡，FXWH-8b株攻毒后72 h活雞均已安樂死處理，導致病毒沒有充足的時間作用于活體細胞，因而未形成核內包涵體。這與國紀壘等[8]報道的血清10型腺病毒在人工感染SPF雞只第5天在肝臟內出現少量嗜堿性的核內包涵體一致。該結果表明以后關于Ⅰ群禽腺病毒的核內包涵體的研究至少需要觀察到攻毒后5 d。

病毒分布檢測結果顯示，2株分離株無論是在死雞還是活雞的肝臟、肺臟、腎臟、腺胃、空腸和盲腸樣品中檢出率均為100%，說明2株分離株在攻毒后均較快在多組織器官定植，這些器官均是2株毒株的靶器官。此試驗結果與趙靜研究的包涵體肝炎在肝臟和盲腸的檢出率較高是一致的。與國紀壘等[8]研究的血清10型感染1日齡SPF雞的結果：肝臟、脾臟和腸道是病毒侵害的主要靶器官是一致的。故這些器官可以作為此病毒分離鑒定的采樣器官。

免疫組化試驗結果顯示，分離株病毒抗原廣泛存在于肝臟細胞中，與趙靜等[9]研究結果一致，但FXWH-4株在腎臟、十二指腸和空腸組織內也有病毒抗原存在，說明不同的病毒株有不同的嗜組織性。

綜上所述，2株膠東地區Ⅰ群禽腺病毒分離株FXWH-8b株和FXWH-4株均有較強的毒力和致病性，可侵害多個雞只組織和器官。