2016-2018年吉林省豬圓環(huán)病毒2型流行病學(xué)調(diào)查及序列分析

苗麗娟，劉東旭，尹柏雙

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，吉林 吉林 132101 ; 2.預(yù)防獸醫(yī)學(xué)吉林省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 吉林 132101)

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2) 隸屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最小的動(dòng)物病毒之一[1],是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎腎病綜合征(PDNS)、豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)、新生仔豬的先天性震顫(CT)等疾病等相關(guān)疾病的主要病原[2]，PCV2可引起免疫抑制，易繼發(fā)其他疾病感染，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

PCV2包括不同亞型，通過(guò)研究得知，PCV2可分為5個(gè)基因型，分別為PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e[3]。試驗(yàn)表明，病理癥狀的不同，毒株之間的差異比亞型之間的差異更重要。PCV2隱性感染一直存在，本課題組主要進(jìn)行豬病毒病的分子診斷，對(duì)于送檢的疑似PCV2感染的病料或血清進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性病料進(jìn)行分離培養(yǎng)，本試驗(yàn)對(duì)2016-2018年吉林省PCV2的感染情況進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，對(duì)分離到的2株P(guān)CV2進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，為該病的防治提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 病料的收集 收集2016-2018年間送檢至吉林省豬生態(tài)養(yǎng)殖及疫病防控科技創(chuàng)新中心的血清和組織病料434份。

1.2 主要試劑 DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，均購(gòu)自康為世紀(jì)有限公司；TaqDNA聚合酶(含10×Buffer 25 mmoL/L MgCl2)、 dNTP、pMD18-T、感受態(tài)細(xì)胞JM109，均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。DNA凝膠回收試劑盒、溴化乙啶(EB)、瓊脂粉，均購(gòu)自維特杰公司。

1.3 方法

1.3.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中PCV2保守區(qū)進(jìn)行全基因組序列，設(shè)計(jì)了4對(duì)引物，引物序列見(jiàn)表1，引物由長(zhǎng)春庫(kù)美生物工程有限公司合成。

1.3.2 PCV2 DNA的提取及陽(yáng)性率檢測(cè) 按照Universal Genomic DNA Kit試劑盒說(shuō)明書操作，從病料組織或血清樣品中提取病毒基因組中DNA，用適量的TE溶解，-20 ℃，保存?zhèn)溆谩?yīng)用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR的擴(kuò)增，調(diào)查吉林省PCV2在2016-2018年之間的流行情況，對(duì)其日齡分布與季節(jié)分布情況進(jìn)行分析。

1.3.3 PCV2全基因組的擴(kuò)增、克隆和測(cè)序 應(yīng)用Oligo6.24軟件設(shè)計(jì)PCV2的4對(duì)引物， 見(jiàn)表1。PCR的反應(yīng)體系為25 μL，10×Buffer 2.5 μL 、F/R(20 pmol/μL) 1 μL、dNTP(2.5 mmol/μL) 3.5 μL，EXTaq酶0.25 μL、滅菌水 13.75 μL。反應(yīng)條件為35個(gè)循環(huán)，預(yù)變性 94 ℃ 5 min以后，進(jìn)入循環(huán) 94 ℃ 50 s, 56 ℃ 1 min 30 s, 72 ℃ 50 s，最后72 ℃延伸 10 min。0.9% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增條帶，將目的基因與pMD-18T載體連接轉(zhuǎn)化，將鑒定后為陽(yáng)性的菌送長(zhǎng)春庫(kù)美生物工程有限公司測(cè)序。

表1 擴(kuò)增PCV2全基因序列的引物Table 1 Primer sequences and locations for PCV2 amplification

1.3.4 PCV2全基因組、Rep、Cap和ORF3基因的序列比對(duì)分析 采用DNASTAR軟件進(jìn)行序列拼接，2017年和2018年隨機(jī)選取1株分離株，使用MegAlign將PCV2-2017/ PCV2-2018與GenBank中收錄的PCV2的國(guó)內(nèi)外參考毒株的全基因組序列、ORF1、ORF2、ORF3基因變異性及同源性進(jìn)行分析，分析其遺傳進(jìn)化關(guān)系，參考毒株見(jiàn)表2。

2 結(jié)果

2.1 PCV2流行病學(xué)調(diào)查 對(duì)434份樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明，檢出167份PCV2陽(yáng)性樣品，在2016-2018年P(guān)CV2感染率為38.5%；感染率最高的年份為2018年，為42.6%;感染率最低的年份為2017年,為33.1%；吉林地區(qū)以中部地區(qū)感染最為嚴(yán)重；且各個(gè)年齡段的豬均可感染PCV2，發(fā)病率以秋冬時(shí)間比較高，具體檢測(cè)結(jié)果如表3、表4、表5、表6所示。

2.2 全基因組序列分析 用DNASTAR軟件將測(cè)得的序列進(jìn)行拼接，結(jié)果表明:PCV2-2017 和PCV2-2018毒株序列全長(zhǎng)都為1 767 bp。核酸同源性分析表明：PCV2-2017與法國(guó)株AF055394同源性最高，可達(dá)99.8%，與 PCV2-2018同源性最低，為80.1%；PCV2-2018與法國(guó)株AY322001同源性最高達(dá)99.8%，與上海株GU124593同源性最低，為77.2%。

表2 進(jìn)化分析采用的參考毒株Table 2 The reference strain list

表3 2016-2018年吉林地區(qū)PCV2感染情況Table 3 The infection type of PCV2 in Jilin from 2016 to 2018

表4 吉林地區(qū)2016-2018年P(guān)CV2地區(qū)分布情況Table 4 The region of PCV2 in Jilin from 2016 to 2018

表5 吉林地區(qū)2016-2018年P(guān)CV2不同日齡分布情況Table 5 The pig of different age groups of PCV2 in Jilin from 2016 to 2018

表6 吉林地區(qū)2016-2018年P(guān)CV2不同季節(jié)分布情況Table 6 Different seasons distribution of PCV2 in Jilin from 2016 to 2018

用MegAlign分析PCV2-2017和PCV2-2018毒株與GenBank中收錄的其他PCV2毒株的遺傳進(jìn)化關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)圖1，由圖1可以看出，PCV2毒株可以分為2個(gè)分支，PCV2-2017和PCV2-2018處于2個(gè)不同的分支中，其中1個(gè)分支中PCV2-2018與國(guó)內(nèi)GU370064、AY691169、AY969004、DQ180393及國(guó)外AY322001、AB426905毒株親緣關(guān)系較近；PCV2-2017與HM102350、JQ809464、GU124593、AF055394、AF055391、GU325757、JX512856組成第2個(gè)分支，與法國(guó)株AF055394親緣關(guān)系最近，同屬于PCV-2b亞型，與JQ809464、HM102350、GU124593親緣關(guān)系也較近。

2.3ORF1和ORF3基因序列變化和同源性分析 PCV2-2017 和PCV2-2018毒株中ORF1基因全長(zhǎng)都為946 bp,編碼Rep蛋白，在GenBank上核酸和氨基酸同源性分析，結(jié)果同源性都為99%，但PCV2-2017在867nt C變?yōu)門，導(dǎo)致丙氨基酸變?yōu)槔i氨基酸。

PCV2-2017和PCV2-2018毒株中ORF3基因長(zhǎng)為315 bp,核酸同源性比對(duì)結(jié)果分別為100%和99%，PCV2-2018在580 nt C變?yōu)門，導(dǎo)致丙氨基酸變?yōu)槔i氨基酸。ORF3編碼的蛋白與病毒在機(jī)體內(nèi)的致病性和病毒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)，該蛋白相對(duì)比較保守。

2.4ORF2基因的序列變化和分析 PCV2-2017和PCV2-2018分離株中Cap基因長(zhǎng)度為702 bp，編碼Cap蛋白。PCV2-2017毒株在GenBank中進(jìn)行核酸同源性比對(duì)，核苷酸同源性在96%～99%；氨基酸同源性比對(duì)，同源性在94%～99%，說(shuō)明PCV2變異主要發(fā)生在ORF2區(qū)，共有12個(gè)點(diǎn)突變，突變主要集中在670～680 nt，有4個(gè)位點(diǎn)突變，其余分散于ORF2的其他位置。PCV2-2018毒株在GenBank中進(jìn)行核酸同源性比對(duì)，核苷酸同源性在99%；氨基酸同源性比對(duì)，同源性在96%～99%，突變的位點(diǎn)主要集中在670～680 nt，有4個(gè)點(diǎn)突變，部分結(jié)果如圖2所示。導(dǎo)致相應(yīng)的氨基酸也發(fā)生改變，這是否導(dǎo)致抗原性發(fā)生改變還需要進(jìn)一步研究。

圖1 部分PCV2基因組序列構(gòu)建的遺傳進(jìn)化分析Fig.1 Genetic evolution analysis of genome sequence of PCV2 isolated▲： PCV2-2017/ PCV2-2018為本試驗(yàn)分離株▲: PCV2-2017/PCV2-2018 were isolated for this experiment

圖2 PCV2-2017 /PCV2-2018吉林株ORF 2核酸序列部分比對(duì)結(jié)果Fig.2 Comparison of PCV2-2017 /PCV2-2018 ORF 2 nucleotide sequences

3 討論

PCV2感染可以引起PMWS等多種疾病的發(fā)生，造成豬體的免疫抑制，繼發(fā)和引起其他疾病的感染和暴發(fā)，目前我國(guó)豬群中PCV2、TTSuVs等病原體感染居高不下，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，近年來(lái)的研究表明，PCV2與TTSuVs感染造成PMWS的暴發(fā)[4-5]。

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)吉林省的2016-2018年部分樣品檢測(cè)，結(jié)果表明，PCV2的感染在我省普遍存在，感染率為38.5%，其中2017年最低，2018年最高，可能與其他疾病的共感染有關(guān)，如腹瀉病的發(fā)生，TTSuVs的共感染有關(guān)，需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。

本試驗(yàn)分離到的PCV2，隨機(jī)選取2017年和2018年的1株分離株，對(duì)全基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行序列分析。本次獲得PCV2-2017基因組全長(zhǎng)1 767 bp,與PCV-2b亞型參考株AF055394親緣關(guān)系最近，所以屬于PCV-2b亞型，2003年以前PCV-2a為主要的流行毒株，現(xiàn)在PCV-2b為流行的主要毒株[6-8]。PCV2-2017ORF1經(jīng)過(guò)測(cè)序拼接后長(zhǎng)度為946bp,ORF1編碼Rep蛋白，僅在867nt位置C變?yōu)門，導(dǎo)致272aa變異，由丙氨基酸變?yōu)槔i氨基酸，對(duì)其功能是否有影響還需要進(jìn)一步探究，Rep蛋白與病毒的復(fù)制相關(guān)，比較保守；ORF3長(zhǎng)度為315bp，編碼的蛋白與病毒的致病性有關(guān)，能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；ORF2測(cè)序拼接后長(zhǎng)度為702bp，編碼Cap蛋白，Cap蛋白是PCV2的主要結(jié)構(gòu)蛋白，與病毒的致病性和抗原表位有關(guān)，具有較大的變異性，是刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)應(yīng)答的重要靶抗原。PCV2-2018與國(guó)內(nèi)的福建、上海、浙江株親緣關(guān)系比較近，與省內(nèi)2017株相對(duì)有一定差異，差異主要集中在ORF2編碼區(qū)，ORF1和ORF3相對(duì)保守區(qū)，所以變異不大。