羊源性D型產氣莢膜梭菌的分離及PCR鑒定

闞 威，張總超，馬艷萍，王謝忠，王文勇，王云平

(1.青海省動物疫病預防控制中心，青海 西寧 810000 ； 2.青海省互助縣動物疫病預防控制中心，青海 互助 810700)

產氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens，C.perfringens)舊稱魏氏梭菌(C.welchii)或產氣莢膜桿菌(Bacillusperfingens)，因在機體內能產生氣體，導致組織氣腫，且能產生莢膜，故名產氣莢膜梭菌[1]。該菌分布較廣，可見于土壤、污水、飼料、食物、糞便以及人畜腸道等，是引起人類食物中毒、人畜氣性壞疽及動物壞死性腸炎、腸毒血癥的主要病原菌之一[2]。產氣莢膜梭菌本身沒有侵襲力，致病性完全取決于毒素的作用[3]。已發現的產氣莢膜梭菌毒素至少有20種，α、β、ε和ι是主要致死毒素，根據產生這4種毒素的能力，可將該菌分為A(α)、B(α、β、ε)、C(α、β)、D(α、ε)和E(α、ι)5個毒素型[1]。D型產氣莢膜梭菌可引起羔羊、綿羊、山羊、牛、馬以及灰鼠的腸毒血癥，山羊小腸結腸炎[4]。

本試驗對青海省互助縣送檢的2份疑似產氣莢膜梭菌病死羊組織，通過細菌學厭氧培養、生化特性并結合分子生物學方法鑒定為D型產氣莢膜梭菌。此試驗對產氣莢膜梭菌病的診斷和檢測具有實際意義，可供梭菌病的診斷參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 待檢材料 互助縣送檢的2份病死羊組織病料(肝臟、肺臟)。

1.1.2 主要試劑和設備 試劑：核酸提取試劑盒，購自天隆生物科技有限公司；強化梭菌，購自杭州微生物試劑有限公司；血瓊脂培養基；2 000 DNA Marker、PCR反應預混酶、50×TAE、瓊脂糖，均購自北京全式金生物技術有限公司；D型和E型產氣莢膜梭菌核酸，由中國農業科學院蘭州獸醫研究所周繼章研究員惠贈。設備：細菌厭氧培養灌、顯微鏡、恒溫培養箱、PCR擴增儀(Bio-RAD，Mexico)；凝膠成像系統(Analytik Jena，AG)、核酸自動提取儀、DYY-12型電腦三恒多用電泳儀和DYCP-31A型電泳槽，均購自北京六一儀器廠。

1.1.3 引物合成 參考已發表的文獻[5-6]，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，產氣莢膜梭菌16S rRNA基因和毒素基因(α、β、ε、ι)引物，引物序列及大小見表1。

表1 16S rRNA基因和毒素基因PCR擴增引物

1.2 方法

1.2.1 病原分離培養 將送檢的2份病料組織(肝臟、肺臟)分別接種于強化梭菌液體培養基厭氧培養，取其24 h培養物劃線接種于強化梭菌瓊脂平板進行純化培養；純化菌落劃線接種于血瓊脂平板，45 ℃培養24 h后觀察菌落形態；隨機挑選血平板上單菌落接種于強化梭菌液體培養基，厭氧培養24 h，涂片革蘭染色鏡檢。

1.2.2 分離株細菌牛乳爆裂發酵試驗 將純化培養的分離株細菌接種于牛乳，45 ℃厭氧培養12 h。待培養結束后觀察試驗結果。

1.2.3 產氣莢膜梭菌毒素基因多重PCR擴增 取純化后強化梭菌液體培養物，利用核酸自動提取儀，提取細菌基因組作為PCR反應模板。同時以參考菌株D型產氣莢膜梭菌和E型產氣莢膜梭菌作為對照。

毒素基因多重PCR擴增：α毒素基因條帶大小為900 bp、β毒素基因條帶大小為611 bp、ε毒素基因條帶大小為396 bp、ι毒素基因條帶大小為293 bp。PCR擴增體系為50 μL：PCR預混酶25 μL，α、β、ε、ι毒素基因上下游引物各1 μL，DNA模板5 μL，雙蒸水12 μL。PCR擴增條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃ 10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 16S rRNA基因PCR擴增和基因同源性及系統發育分析 16S rRNA基因PCR擴增：16S rRNA基因條帶大小為4 811 bp，PCR擴增體系為50 μL：PCR預混酶25 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，雙蒸水21 μL。PCR擴增條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

16S rRNA基因的PCR擴增產物送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序，測序結果在NCBI數據庫中進行Blast比對分析，并應用MEGA 5.1軟件對16S rRNA基因序列進行同源性分析及系統進化樹的構建。

2 結果與分析

2.1 病原分離培養及菌落形態特征 從2份病料組織中分離得到1株使血平板呈β溶血的菌株。其菌落形態特征為表面光滑、隆起、半透明、邊緣整齊，菌落直徑2～5 mm，革蘭染色為陽性大桿菌。見中插彩版圖1和圖2。

2.2 分離株細菌牛乳爆裂發酵試驗 分離株細菌接種牛乳45 ℃培養12 h后，牛乳呈“爆裂發酵”，結果見中插彩版圖3。

2.3 產氣莢膜梭菌毒素基因多重PCR擴增 分離株細菌和參考菌株D型產氣莢膜梭菌、E型產氣莢膜梭菌經α、β、ε、ι毒素基因多重PCR擴增，分離株細菌擴增可得α毒素基因(900 bp)和ε毒素基因(396 bp)的目的基因條帶，擴增結果如圖4所示。

圖4 分離株細菌毒素基因多重PCR擴增結果Fig.4 Multiple PCR amplification of bacterial toxin geneM：DNA 2 000 Marker； 1：分離株細菌； 2：參考菌株D型產氣莢膜梭菌； 3：參考菌株E型產氣莢膜梭菌M:DNA 2 000 Marker; 1:Isolated bacterias; 2:Clostridium perfringens type D; 3:Clostridium perfringens type E

2.4 16S rRNA基因PCR擴增和同源性及系統發育分析 分離株細菌經產氣莢膜梭菌16S rRNA基因PCR擴增，可得481 bp的目的基因條帶，擴增結果如圖5所示。對分離菌株細菌16S rRNA基因進行測序，測序結果顯示：分離株細菌的16S rRNA基因序列在線Blast分析顯示，其16S rRNA基因序列與GenBank上已登錄的(登錄號:NR113204.1、NR121697.2)產氣莢膜梭菌相應序列具有高度同源性(≥99.0%)。根據16S rRNA基因序列與上述同源性較高的D型產氣莢膜梭菌GenBank (登錄號:NR113204.1、NR121697.2)的相應序列和相關D型產氣莢膜梭菌(登錄號:LC386311.1、KU714939.1，來源見表2)建立系統進化樹，如圖6所示，分離株細菌與參考菌株分屬2個大的分支，其中分離株與其同源性較高的NR113204.1、NR121697.2處于一個小的分支，且分離株細菌同伊朗疫苗毒株(KU714939.1)的遺傳關系較為親密。

圖5 分離株細菌16S rRNA PCR擴增結果Fig.5 PCR amplification results of 16S rRNA of isolated bacteriasM：DNA 2 000 Marker； 1：分離株細菌M:DNA 2 000 Marker; 1:Isolated bacterias

表2 4株D型產氣莢膜梭菌參考菌株的名稱及來源Table 2 The name and source of a reference strain of Clostridium perfringens

3 討論

產氣莢膜梭菌是一種重要的人獸共患的病原體，其釋放的毒素可引起多種動物的腸毒血癥和壞死性腸炎，也是一種在人醫臨床上比較常見的食物中毒致病菌。羊腸毒血癥(Enterotoxemia)就是由D型產氣莢膜梭菌感染引起的，又因剖檢該病死動物時，發現腎臟組織軟化現象，故稱該病為“軟腎病”，根據其臨床癥狀此類病又稱之為“類快疫”[7]。該病多呈散發，可感染綿羊、山羊，2～12月齡易發病。其病程短，多數為突發，病畜多數為無癥狀突然死亡，有的可見四肢抽搐等癥狀；有的則沒有表現出神經癥狀，而是呈現虛脫、昏迷或悄然死亡[8]。D型產氣莢膜梭菌主要依附在土壤、污水、羊腸道以及糞便中，春夏交替之季或者秋季是羊腸毒血癥的高發期，因為在此期間羊主要以谷類與草料為主食，此類主食中含有豐富的蛋白質，通過胰蛋白酶轉化成了ε原毒素，繼而引發羊腸毒血癥[9]。此次送檢的2份病死羊組織，懷疑為羊梭菌性疫病，根據送檢單信息，該養殖戶存欄藏系綿羊600多只，死亡14只，10月6日對羊只進行了羊小反芻獸疫和羊四聯苗免疫。但是該養殖場在羊只發病死亡期間曾飼喂大量麻渣，因此懷疑此次疫情的發生與飼喂高蛋白的麻渣有必然聯系。

圖6 基于16S rRNA基因序列的遺傳進化樹Fig.6 Genetic evolution tree based on 16S rRNA gene sequence

近年來青海省牛、羊梭菌病呈散發形勢流行，對于梭菌病的防控只能采用疫苗免疫進行預防，但是鑒于產氣莢膜梭菌分型較多，每型的致病性各異，傳統細菌學診斷方法耗時耗力，應用一種快速的產氣莢膜梭菌診斷方法，可以大大節省時間和財力。本試驗通過查閱國內外相關文獻，主要以分子生物學手段為基礎，參照已發表文獻的產氣莢膜梭菌16S rRNA和毒素基因引物，利用多重PCR分型方法，對臨床分離的產氣莢膜梭菌進行了分型鑒定。為今后產氣莢膜梭菌病的診斷、流行病學調查、制定防制措施提供科學依據，也為疫苗的研究和使用提供技術支持和儲備。