不同保存條件下乳腺癌石蠟切片PR、ER和HER-2狀態的變化

羅勝　宋彥錕

【摘要】 目的：探究乳腺癌標本于不同條件下保存對石蠟切片免疫組化指標PR、ER和HER-2表達的影響。方法：擇取2018年1月-2019年1月筆者所在醫院病理科42份乳腺癌標本為研究對象，取新鮮樣本石蠟包埋連續切片，免疫組化測定PR、ER和HER-2。另獲取乳腺癌標本浸潤部分組織，分別于超低溫、低溫和室溫條件下密封保存，并于12個月后復行免疫組化測定PR、ER和HER-2。觀察三種保存條件下組織樣本與新鮮樣本的免疫組化測定結果及指標信號強度變化。結果：-80 ℃超低溫保存樣本中，PR、ER和HER-2陽性表達強度與新鮮樣本一致，1例ER 3+樣本信號降至2+，余同金標準一致。4 ℃低溫保存樣本中，PR信號減弱和消失14份，ER信號減弱和消失12份，HER-2信號減弱和消失13份。20 ℃室溫保存樣本中，僅4例PR，5例ER，7例HER-2表達信號與金標準相符，余不同程度減弱或消失。結論：乳腺癌石蠟切片超低溫蠟封保存可以有效隔絕氧化，維持良好的組織表面抗原性，對PR、ER和HER-2狀態影響較小，免疫組化檢測可行性高，效果優于低溫和常溫保存。

【關鍵詞】 乳腺癌 石蠟切片 保存條件 免疫組化

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2020.21.059 文獻標識碼 B 文章編號 1674-6805（2020）21-0-02

Changes of PR， ER and HER-2 Status in Paraffin Section Breast Cancer under Different Storage Conditions/LUO Sheng， SONG Yankun. //Chinese and Foreign Medical Research， 2020， 18（21）： -144

[Abstract] Objective： To investigate the effect of breast cancer specimens stored under different conditions on the expression of immunohistochemical indexes PR， ER and HER-2 in paraffin sections. Method： From January 2018 to January 2019， 42 breast cancer specimens from the pathology department of our hospital were selected as research subjects. Fresh samples were embedded in paraffin-embedded serial sections， and PR， ER and HER-2 were determined by immunohistochemistry. Partially infiltrated tissues were obtained from breast cancer specimens， which were sealed and stored at ultra-low temperature， low temperature and room temperature， respectively， and PR， ER and HER-2 were determined by immunohistochemistry after 12 months. The immunohistochemical results of tissue samples and fresh samples under the three storage conditions were observed， and the changes in the signal intensity of the indicators were observed. Result： The positive expression intensity of PR， ER and HER-2 in cryopreserved samples at -80 ℃ was the same as that in fresh samples， the signal of ER3+ in one sample decreased to 2+， and the rest was the same as that in gold standard. In the samples stored at 4 ℃ at low temperature， the PR signal decreased and disappeared in 14， ER signal decreased and disappeared in 12， and HER-2 signal decreased and disappeared in 13. Only 4 PR， 5 ER and 7 HER-2 signals in 20 ℃ room temperature preserved samples were consistent with the gold standard. Conclusion： Preservation of ultra-low temperature wax seals for breast cancer paraffin sections can effectively isolate oxidation and maintain good tissue surface antigenicity. It has little effect on the status of PR， ER and HER-2. Immunohistochemical detection is highly feasible and the effect is better than low temperature and normal temperature preservation.

[Key words] Breast cancer Paraffin section Storage conditions Immunohistochemical

First-authors address： The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University， Fuzhou 350005， China

乳腺癌是女性常見惡性腫瘤。流行病學統計顯示，乳腺癌發病率居我國女性惡性腫瘤第一位，死亡居第六位，年發病和死亡人數分別占世界的12%和10%，且受多種因素影響，我國乳腺癌發病率增長速度超全球平均水平2倍以上，疾病形勢嚴峻，是嚴重威脅女性生命健康的公共衛生問題[1]。因此，為提高檢測結果準確性，避免不必要的組織浪費，臨床常在組織切片時保留未染色切片[2-3]。為探究理想的組織切片長期保存條件，保證免疫組化檢測質量，本文擇取筆者所在醫院病理科乳腺癌標本，觀察石蠟切片在不同保存條件下的免疫組化指標改變情況，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

擇取2018年1月-2019年1月筆者所在醫院病理科42份乳腺癌標本為研究對象。納入標準：病理組織學檢查證實為浸潤性乳腺癌的根治手術切除樣本;新鮮病理樣本免疫組化檢查研究指標均呈陽性且無明顯異質性。患者對本研究均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 DAKO公司Envision檢測系統、兔抗人PR單克隆抗體（克隆號1E2）、兔抗人ER單克隆抗體（克隆號SP1）、兔抗人HER-2單克隆抗體（克隆號4B5）、免疫組化EliVison試劑盒、Leica RM2254石蠟切片機、Olympus BX53熒光顯微鏡等。

1.2.2 操作方法 取新鮮浸潤乳腺癌手術標本，制成5 mm×

3 mm×3 mm組織塊，酒精梯度脫水，石蠟包埋，上切片機以

3 μm厚度連續切片，選擇腫瘤組織豐富區域的切片樣本，免疫組化測定PR、ER和HER-2。通過HE染色鏡下觀察，確定乳腺癌浸潤組織并標記位點，以組織芯片儀打孔鉆取組織柱，將獲取的樣本移至受體蠟塊上，送入電熱恒溫烤箱，55 ℃烘烤至半融化狀態（60～90 min），取出后室溫冷卻，組織芯片蠟塊制備完成。將制作好的蠟塊上切片機以3 μm厚度連續切片9張，分成3組，3張/組，貼附于黏附載玻片（表面帶正電荷），電熱恒溫烤箱55 ℃烤片3 h后，分別于超低溫（-80 ℃蠟封）、低溫（4 ℃）和室溫（20 ℃）條件下密封保存。12個月后取樣，復行免疫組化測定PR、ER和HER-2。將組織切片脫蠟至水，采用預處理液80 ℃浸泡10 min，去離子水漂洗5 min，自然晾干，胃酶37 ℃消化30 min，同法漂洗晾干，酒精梯度脫水后變性雜交，室溫下暗處，以0.3%乙基苯基聚乙二醇（NP-40）刷洗組織切片，再以70 ℃浸泡5 min，復染熒光染料DAPI送于顯微鏡下觀察。

1.3 觀察指標及評價標準

由病理科兩名資深醫師共同完成結果判讀，乳腺癌研究樣本與新鮮樣本PR、ER免疫組化結果判讀參照ACSO/CAP《乳腺癌患者雌激素受體及孕酮受體免疫組織化學檢測指南》（2010版）[5];乳腺癌研究樣本與新鮮樣本HER-2免疫組化熒光原位雜交檢測結果判讀參照《乳腺癌HER-2檢測指南》（2014版）[5]。

1.4 統計學處理

以SPSS 21.0軟件進行數據分析，計數資料以率（%）表示，采用字2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

以手術切除新鮮樣本免疫組化檢測結果為金標準，-80 ℃超低溫保存樣本中，PR與HER-2陽性表達強度及范圍均同金標準，1份ER 3+樣本信號降至2+，余同金標準。4 ℃低溫保存樣本中，PR信號一般減弱（3+降至2+，或2+降至1+）7份，明顯減弱（3+降至1+）3份，信號消失（任意+降至-）4份;ER信號一般減弱4份，明顯減弱1份，信號消失7份;HER-2信號一般減弱3份，明顯減弱6份，信號消失4份。20 ℃室溫保存樣本中，僅4份PR，5份ER，7份HER-2表達信號與金標準相符，余不同程度減弱或消失，見表1。新鮮樣本與研究樣本HER-2免疫組化結果對比見圖1。

注：a為新鮮樣本HER-2（2+）;b為研究樣本HER-2（2+）。

3 討論

甲醛固定石蠟包埋是臨床處理病理組織塊的常用方法，不僅可以達到支持增硬的作用，還可以很好地防止組織自溶與抗原擴散，從而長時間保存組織核酸及抗原，為病理檢測提供可靠樣本[6]。但隨著保存時間的延長，組織切片仍會不可避免地受環境因素影響而逐漸發生氧化改變，是導致免疫組化和分子檢測假陰性結果的重要原因[7-8]。有報道指出，光作用、熱作用及環境中的化學因子作用均會對組織抗原活性造成影響[9]。另有研究證實，連續紫外線照射、長時間或高溫烘烤，會造成組織切片抗原丟失[10]。

為延長組織切片有效保存時間，保證病理檢測與指標判讀準確，本研究對理想的樣本切片保存條件進行探究。研究統一采用組織芯片進行樣本保存，有利于質量控制，減少試驗誤差，同時節約試劑和材料[11-12]。研究結果顯示，不同條件下保存12個月的乳腺癌石蠟切片樣本，DNA保存均良好，可以檢測到組織抗原，但抗原活性均存在不同程度改變。其中，室溫和低溫條件下保存的組織樣本免疫組化指標PR、ER和HER-P改變較為明顯，特別是室溫下保存樣本，絕大多數信號明顯減弱甚至消失，提示氧化作用的存在。而超低溫蠟封保存PR與HER-2陽性表達強度及范圍同金標準一致，ER同金標準基本一致，提示超低溫蠟封保存對隔離氧化、保持組織表面抗原更具有效性與可行性。另有研究證實，蠟封聯合低溫的保存方法可以有效保存穩定抗原，獲得與新鮮切片表達強度一致率超過90%的保存效果。