RON/PI3K信號通路在子宮內膜癌中的表達及臨床意義

莊曉蘋 邵玲燕 林瓊瓊

子宮內膜癌是女性生殖道最常見的惡性腫瘤之一。隨著社會經濟的發展，人們生活方式、飲食結構的改變以及雌激素等藥物的廣泛使用，子宮內膜癌發病率呈逐年上升趨勢[1]。研究表明，酪氨酸激酶受體（RON）異常表達導致自身磷酸化，激活下游通路，而下游通路RON/磷酯酰肌醇3-激酶（PI3K）是蛋白質合成的主要信號調節通路，該通路激活后可以產生一系列級聯反應，從而促進細胞的增殖、侵襲、轉移[2]。目前國內尚無RON/PI3K信號通路在子宮內膜癌中表達的相關報道。本研究通過檢測RON/PI3K信號通路在子宮內膜癌中的表達，為設計新型靶向藥物對該病患者進行精準治療提供參考。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2010年1月至2013年1月在溫州市中西醫結合醫院婦產科住院的160例患者的子宮內膜組織，其中子宮內膜癌80例（子宮內膜癌組），不典型增生80例（不典型增生組）；并收集同期20例因子宮肌瘤行全子宮切除術患者的正常子宮內膜組織（正常組）。本研究經溫州市中西醫結合醫院醫學倫理委員會批準通過，患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 試劑 兔抗人 RON（ab85063）、PI3K（ab32089）、磷酸化 PI3K（pPI3K）（ab182651）抗體均購自美國 Abcam公司，RT-PCR引物由大連TAKARA公司合成，ECL化學發光底物購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2.2 子宮內膜組織RON、PI3K和pPI3K蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。提取總蛋白，用BCA法測定總蛋白濃度。蛋白上樣量50μg，12%SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉法轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，TBST沖洗15min×3次。加入兔抗人RON（1:2 500稀釋）、PI3K（1∶5 000稀釋）、pPI3K（1∶5 000 稀釋）抗體，室溫孵育1.5h，4℃冰箱過夜。TBST 沖洗15min×3次，加入二抗（1:5 000），室溫孵育1.5h，TBST沖洗10min×3次。加入ECL化學液，成像儀上進行曝光獲得凝膠圖像。應用Image J軟件對目的蛋白和內參蛋白的灰度值進行分析，計算出目的蛋白的相對表達水平（目的蛋白與內參蛋白灰度值的比）。

1.2.3 子宮內膜組織RON和PI3K mRNA表達水平檢測 采用RT-PCR法。嚴格按照Trizol RNA試劑盒說明提取總RNA，并將RNA反轉錄為cDNA。以同一cDNA為模板，PCR反應體系為20μl，反應條件如下：95℃預變性 30s；95℃ 5min，60℃ 30min，72℃ 1min，40個循環；最后72℃延伸7min，至反應結束。引物序列：RON 上游引物：5′-AAGGATGTGCTGATTCCCCA-3′，下游引物：5′-TACCAATGAGAGCCAGCACA-3′；PI3K 上游引物：5′-CCTATTGTCGTGCATGTGGG-3′，下游引物：5′-AATCTGGTCGCCTCATTTGC-3′；GAPDH 上游引物：5′-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3′，下游引物：5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′。以 GAPDH作為內參，RT-PCR反應結束后得出目的基因及內參基因的Ct值，采用 2-ΔΔCt法進行相對定量，每樣本重復3次，最后取平均值。

1.3 子宮內膜癌患者術后隨訪 采用電話及定期復查的方式隨訪，隨訪截止時間為2018年12月30日，以死亡或復發、轉移為隨訪終點。

1.4 統計學處理 采用SPSS 20.0統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組子宮內膜組織RON、PI3K和pPI3K蛋白表達水平比較 與正常組比較，子宮內膜癌組和不典型增生組RON和pPI3K蛋白表達水平均上升，PI3K蛋白表達水平均下降，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。與不典型增生組比較，子宮內膜癌組RON和pPI3K蛋白表達水平均上升，PI3K蛋白表達水平下降，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1和圖1。

表1 3組子宮內膜組織RON、pPI3K和PI3K蛋白表達水平比較

圖1 3組子宮內膜組織RON、PI3K和pPI3K蛋白表達的電泳圖

2.2 3組子宮內膜組織RON和PI3K mRNA表達水平比較 與正常組比較，子宮內膜癌組和不典型增生組RON和PI3K mRNA表達水平均下降，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。與不典型增生組比較，子宮內膜癌組RON和PI3K mRNA表達水平均下降，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表 2。

表2 3組子宮內膜組織RON和PI3K mRNA表達水平比較

2.3 子宮內膜癌患者術后隨訪情況 子宮內膜癌患者術后隨訪時間為1～60個月，中位生存期為44個月。死亡15例，復發/轉移3例，無瘤生存62例。

3 討論

腫瘤的侵襲和轉移是一個動態生物學過程，涉及多種分子的異常表達和相關信號傳導通路的調控。RON屬于人類受體酪氨酸激酶家族（RTK）中的Met原癌基因亞家族，其生物學效應主要是通過與巨噬細胞刺激蛋白（MSP）結合而活化，介導多種細胞內信號級聯反應，在調節細胞生長、增殖、表型轉化、侵襲遷移等多個方面起到重要作用[3]。本課題組前期研究發現RON蛋白在正常子宮內膜組織、不典型增生子宮內膜組織和子宮內膜癌組織中表達水平呈遞增趨勢；Cox單因素回歸分析顯示，子宮內膜癌患者的預后與腫瘤組織學分級、c-Met/RON異常表達、c-Met/RON共同高表達有關；Cox多因素回歸分析顯示，腫瘤組織學分級高（低分化）、c-Met/RON共同高表達是子宮內膜癌預后不良的獨立危險因素[4]。此外，本課題組在實驗中還發現，RON及其下游PI3K信號通路的異常激活[4]。這個結果與Bieniasz等[5]提出在缺氧狀態下RON可通過激活PI3K介導細胞增殖、存活、遷移參與腫瘤的發生的研究結論一致。

PI3K存在于細胞質中，是磷脂激酶家族中的一個重要成員[6]，具有脂類激酶活性與蛋白激酶活性。PI3K主要從酪氨酸激酶連接受體傳遞信號，當RON與特異性配體MSP結合后，通過RON受體分子二聚化而產生自身激酶域的磷酸化，與p85α上的SH2區結合，引起PI3KⅠA二聚體構象改變而激活PI3K[7]。PI3K激活后在質膜上產生第二信使三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3），PIP3通過與Ak的N端PH結構域結合，將蛋白激酶B（Akt）轉位于細胞膜上。同時，在3-磷酸肌醇依賴性激酶1（PDK1）協助下，催化 Akt蛋白的蘇氨酸磷酸化位點（Thr308）磷酸化，并通過3-磷酸肌醇依賴性激酶2（PDK2）催化絲氨酸磷酸化位點（Ser473）磷酸化，從而最大限度激活Akt[8]。過度活化的Akt激活其下游哺乳動物雷帕霉素靶蛋白，可以引起腫瘤細胞的快速增殖、蛋白分泌增加、細胞周期加快、G1期時程縮短，從而促進腫瘤的迅速發生、發展[9-11]。因此，RON/PI3K信號通路是蛋白質合成的主要信號調節通路，參與細胞增殖、分化、遷移等的調節。目前已有研究發現RON及其下游信號通路的異常激活（如PLCγ/DAG/PKC通路、PI3K/Akt通路、Ras/Raf/MAPK通路等）與膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、膽管癌、前列腺癌等[12-16]多種惡性腫瘤的發生、發展密切相關，有可能成為腫瘤治療的一個潛在的重要靶點，因而備受關注。RT-PCR法證實，與不典型增生組和正常組比較，子宮內膜癌組RON和PI3K mRNA表達水平均下降，表明RON/PI3K與子宮內膜癌發生、發展有密切關系。

RON/PI3K牽涉各種腫瘤的進展和轉移，包括黏附、侵襲、遷移、增殖、抑制凋亡。Ling等[2]研究RONΔ165E2變異體通過張力蛋白同源蛋白（PTEN）磷酸化激活PI3K/AKT通路，促使腫瘤的發生，在67例人類結直腸癌樣本中，約58%的樣本存在該變異體高表達，并且與腫瘤浸潤深度也呈正相關。Liu等[17]發現短小RON能通過PI3K信號通路來自發主動地引起乳腺癌細胞的轉移。PI3K通常以無活性的方式存在細胞質中，受到一些基因刺激后pPI3K磷酸化激活，進一步激活其下游因子如B細胞淋巴瘤因子2（Bcl-2）家族、p53、叉頭轉錄因子等，從而促進腫瘤細胞的調亡、增殖、分化及遷移。本研究Western blot法檢測結果顯示RON和pPI3K蛋白在子宮內膜癌組表達最高，而在不典型增生組表達量較少，正常組最弱，提示RON和pPI3K表達量隨著子宮內膜癌的進展是逐漸增加的，其腫瘤惡性程度越高，pPI3K磷酸化越明顯，進一步證實RON通過刺激pPI3K磷酸化，激活PI3K信號通路途徑促進子宮內膜癌的浸潤、轉移。

綜合文獻證據和本課題研究結果，可以認為RON/PI3K與子宮內膜癌的發生、發展相關，兩者有可能作為腫瘤標志物用于子宮內膜癌的診斷和治療，這為筆者了解RON調控子宮內膜癌轉移的機制拓展了思路，同時也為子宮內膜癌轉移機制的研究和相關靶向新藥物的研發提供新的啟示。