一種檢測病毒滅活血漿亞甲藍殘留量試劑盒的應用評價

（深圳市龍崗區中心血站質控科，廣東 深圳 518172）

輸血技術是現代醫學不可缺少的重要治療手段，但存在經輸血傳染的病毒性疾病的感染風險，因此，滅活血液中的病毒是臨床上保障輸血安全的重要措施之一[1]。當前，為增加輸血安全性，減低臨床輸血病毒感染的風險，采供血機構主要采用亞甲藍光化學法滅活血漿中的病毒[2]。亞甲藍滅活血漿的亞甲藍釋放量有效濃度為1.0～5.0 μmol，以保證有效滅活病毒；在滅活病毒以后，濾除亞甲藍需使用一次性病毒滅活過濾器，使亞甲藍最大殘留量不超過0.3 μmol/L（臨床用血漿的亞甲藍殘留量），以保證大劑量輸血后體內亞甲藍的累積不會過多，從而確保用血安全[3]。亞甲藍殘留量是血站制備的血液成分病毒滅活血漿（亞甲藍光化學法）質量監測指標之一[4]?！堆炯夹g操作規程》（2019版）[5]介紹了采用自配試劑檢測亞甲藍殘留量的方法，但自配試劑存在標準品溯源性、冰乙酸（分析純）安全性、試劑配制耗時、試劑配制誤差等問題。同時，規程規定其他經驗證可使用的方法亦可用于亞甲藍殘留量的檢測。本文通過對一種檢測病毒滅活血漿亞甲藍殘留量試劑盒與自配試劑的比較分析，評估其可行性，報道如下。

1 材料與方法

1.1 樣本來源：我站合格庫中抽取已冰凍的病毒滅活新鮮冰凍血漿和病毒滅活冰凍血漿各10袋。37 ℃水浴復溶后取樣15 mL，分成兩等份備用。

1.2 儀器與試劑：722G可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司），亞甲藍（天津市光復精細化工研究所），甲醇（廣東光華科技有限股份公司），冰乙酸（天津市富宇精細化工有限公司），Water Oasis小柱（Waters Corporation Milford，Massachusetts USA），真空固相萃取裝置-隔膜真空泵（天津市津滕實驗設備有限公司），離心機（德國Sigma公司），亞甲藍測定試劑盒（北京瑞爾達生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 試劑盒操作步驟

1.3.1.1 亞甲藍標準品（0.5 μmol/L）：采用試劑盒配套的可追溯至企業工作標準品的校準品。精密量取亞甲藍校準品40 μL置于一試管內，加未經亞甲藍處理合格血漿360 μL混合后備用。

1.3.1.2 亞甲藍質控品（0.3 μmol/L）：采用試劑盒配套的亞甲藍質控品。精密量取亞甲藍質控品40 μL置于一試管內，加未經亞甲藍處理合格血漿360 μL混合后備用。

1.3.1.3 樣品處理：固相萃取裝置上裝入3 mL SSH2P小柱數支，連接真空泵并檢查抽真空效果。用3 mL R1活化小柱。在其中兩只小柱中分別加入0.3 mL血漿亞甲藍校準品和血漿亞甲藍質控品，其余小柱中加入6 mL待測血漿。亞甲藍殘留量萃取后，用3 mL R2清洗，隨后用含2 mL R3洗脫。于3500 rpm離心洗脫液5 min，取上清液作為樣本溶液。

1.3.1.4 亞甲藍含量測定：用R3作試劑空白，各管吸光度在653 nm波長處測定。根據試劑盒說明書計算公式計算測試樣本亞甲藍殘留量。

1.3.2 自配試劑操作步驟：參照《血站技術操作規程》（2019版）附錄F.19亞甲藍殘留量。

1.3.2.1 亞甲藍標準濃縮儲備液配制：精密稱取亞甲藍對照品粉末38.0 mg，用蒸餾水溶解并稀釋至100 mL，配制成1.0 mmol/L的亞甲藍標準濃縮儲備液，避光保存。

1.3.2.2 標準品制備：緊密量取1.0 mmol/L亞甲藍濃縮儲備液50 μL，置50 mL容量瓶中，用血漿稀釋至刻度，配成亞甲藍濃度為1.0 μmol/L的亞甲藍標準品。取3 mL固相提取柱，置于固相提取裝置上，取6 mL甲醇活化，加入6 mL標準品，提取亞甲藍；用30%甲醇6 mL清洗，之后用含1%乙酸的甲醇溶液6 mL洗脫，于3500 rpm離心洗脫液10 min，取上清液作為標準品溶液。

1.3.2.3 樣品制備：取3 mL固相提取柱，置于固相提取裝置上，取6 mL甲醇活化，加入6 mL供試血漿，提取亞甲藍；用30%甲醇6 mL清洗，之后用含1%乙酸的甲醇溶液2 mL洗脫（樣本濃縮3倍），于3500 rpm離心洗脫液10 min，取上清液作為樣品溶液。

1.3.2.4 測定和計算：用含1%乙酸的甲醇溶液做試劑空白，在653 nm處測定吸光度。根據規程中的計算公式計算測試樣本亞甲藍殘留量。

1.4 統計學處理：實驗結果用SPSS22.0統計學軟件進行統計學處理，計量資料用±s表示，數據比較用t檢驗分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 標準品溯源性：見表1。

表1 兩種試劑標準品溯源性

2.2 安全性：冰乙酸（分析純）危險性類別屬于酸性腐蝕品。見表2。

表2 兩種試劑所用試劑

2.3 時限性：兩種試劑檢測每批次樣本耗時：試劑盒檢測每批次（10個樣本）需要0.5 h，自配試劑檢測每批次（10個樣本）需要1 h。見表3。

表3 兩種試劑檢測每批次樣本耗時

2.4 結果可比性：兩種試劑平行檢測病毒滅活血漿亞甲藍殘留量測定結果：亞甲藍質控品檢測結果均在控。兩種試劑平行檢測病毒滅活血漿亞甲藍殘留量測定結果差異性無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 兩種試劑亞甲藍殘留量測定結果（μmol/L）

3 討論

根據《獻血者健康檢查要求》（GB18467-2012）規定，獻血后血液檢測只局限于對乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒(HCV)、艾滋病病毒（HIV）、梅毒（TP）進行病毒檢測，不可能完全杜絕經輸血傳播的病毒感染風險[6]。亞甲藍能與病原微生物核酸和蛋白結合，在適當波長的熒光照射下，發生一系列化學或光生物效應導致病原體失活達到滅活血液病毒的目的[7]。同時，一次性使用血漿病毒滅活器材能有效地去除血漿中殘存的白細胞，提高病毒滅活的安全性，能有效地控制病毒滅活血漿的安全性[8]，尤其是對脂包膜病毒的滅活效果很理想[9]。研究證明，亞甲藍光化學法能有效滅活血漿中多種脂質包膜病毒以及尚未列入檢測的病毒[10-11]。亞甲藍光照法中亞甲藍的釋放量是決定病毒滅活程度的關鍵參量，亞甲藍釋放量過高，血漿中殘留量過大，易于導致累積毒性，而過低，又不能保證病毒滅活的效果。因此，需要對病毒滅活血漿中殘留的亞甲藍進行檢測。亞甲藍的檢測方法有固相萃取-分光光度法、增敏熒光光譜法、高效液相色譜法、化學發光法、共振瑞利散射光譜法[12]。《血站技術操作規程》（2019版）采用固相萃取-分光光度法進行病毒滅活血漿亞甲藍殘留量的檢測。但是在實際檢測工作中，規程采用的亞甲藍殘留量檢測項目的常規檢測方法操作工費時[13]。采用自配試劑檢測病毒滅活血漿亞甲藍殘留量，工作流程煩瑣，每次配制時由于工作人員、試劑、操作等原因造成的批間誤差也大[14]。血站質量管理部門檢測結果直接反應血液內在質量和血站采供血過程控制情況，直接影響采供血過程的糾偏效果[15]。在血液抽檢過程中嚴格按照標準操作規程確保檢測結果的準確性，將血液的每一步環節把握到位，才能保障血液安全[16-17]。試劑盒生產標準化，按照GB/T21415-2008《體外診斷醫療器械生物樣品中量的測量校準品和控制物質賦值的計量學溯源性》要求，試劑盒校準品溯源至企業工作校準品（由純品采用稱量法賦值）。而自制試劑中的亞甲藍標準品，無相關標準，無法溯源。試劑盒中包含的R1：甲醇，R2：30%甲醇，R3：1%乙酸甲醇三種試劑，均為無毒無害試劑。而配制1%乙酸甲醇溶液所用到的冰乙酸（分析純）危險性類別屬于酸性腐蝕品，存在生物安全隱患。試劑盒生產標準化，試劑穩定性為6個月。自配試劑的標準品、30%甲醇、1%乙酸甲醇需要進行配置，而且配置后穩定性難以評估，往往需要在實驗過程中現配先用，耗時，因而，在檢測每批次樣本時，試劑盒由于不需要進行試劑的配制，要比自配試劑節省0.5 h。

從本文測定結果來看，兩種試劑平行檢測病毒滅活血漿亞甲藍殘留量測定結果差異性無統計學意義（P＞0.05），表明試劑盒與《血站技術操作規程》（2019版）介紹的自配試劑在檢測病毒滅活亞甲藍殘留量上結果一致，符合其要求。

綜上，商品化試劑盒標準品可溯源、安全、省時、結果準確，可以用于病毒滅活血漿亞甲藍殘留量的檢測。