基于網絡藥理學和分子對接技術預測復方絞股藍膠囊治療口腔扁平苔蘚的分子機制

李悅悅,章斌,陳慧瑾

(上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院藥劑科，上海 200011)

口腔扁平苔蘚(oral lichen planus，OLP)是一種常見口腔黏膜慢性炎癥性疾病，其患病率為0.1%～4%[1]。由于長期糜爛，病損有惡變傾向，癌變率為0.4%～12.5%[2]。目前治療OLP的一線用藥包括腎上腺皮質激素類藥物、免疫抑制劑和氯喹等，這些藥物雖能緩解OLP急性發作期癥狀，但病情容易反復，且有明顯的毒副作用。復方絞股藍膠囊是我院的特色制劑，其以絞股藍為主藥，另添加燈盞花素，具有提高機體免疫力、活血化瘀之功效。臨床研究表明，其對OLP等斑紋類疾病的損害范圍和上皮異常增生改善作用顯著[3-6]，但目前對復方絞股藍膠囊治療OLP、預防惡變的物質基礎與作用機制尚不清楚。網絡藥理學是利用生物學數據庫，采用系統生物學方法，通過構建“疾病-基因-靶點-藥物”互作網絡，觀察藥物對疾病的干預與影響。分子對接則是根據大分子受體的結構特征，及受體與配體小分子之間的相互作用來預測藥物與受體的結合方式及其親合力的一種理論模擬方法[7]。本文采用以上兩種方法對復方絞股藍膠囊治療OLP的分子機制進行研究，預測復方絞股藍膠囊的主要活性成分，為OLP等斑紋類疾病的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 數據庫與軟件

本研究使用的數據庫與軟件包括：中藥系統藥理學數據庫與分析平臺TCMSP (http://tcmspw.com/tcmsp.php)、有機小分子生物活性數據庫Pubchem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)、生物活性小分子靶向預測平臺SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch)、通用蛋白質數據庫 Uniprot (https://www.uniprot.org)、人類基因綜合數據庫 Genecards (https://www.genecards.org)、在線人類孟德爾遺傳數據庫OMIM(https://omim.org)、網絡拓撲屬性分析軟件Cytoscape3.6.1、蛋白互作平臺STRING version 11.0(https://string-db.org)、三維分子模型軟件Pymol 1.8、分子建模和模擬平臺Discovery Studio 3.5和分子對接軟件AutoDock Vina。

1.2 建立復方絞股藍膠囊候選化合物庫

利用TCMSP數據庫，分別以“絞股藍”和“scutellarin”(燈盞乙素)為關鍵詞檢索，根據口服生物利用度(oral bioavailablity，OB)>30%和類藥性(drug likeness，DL)>0.18 的原則篩選候選化合物，并獲得其作用的靶點信息[8]。對TCMSP數據庫無靶點信息的候選化合物，通過PubChem數據庫獲得其Canonical SMILES，將其導入Swiss Target Predicition數據庫補充空缺的成分靶點。

1.3 藥物作用靶點篩選

在 Genecards和OMIM數據庫中輸入關鍵詞“oral lichen planus”，得到OLP相關靶基因。將OLP相關靶基因與藥物作用靶點基因映射篩選，找出兩者的交集基因，為復方絞股藍膠囊治療OLP的靶點。采用Cytoscape 3.6.1軟件構建復方絞股藍膠囊治療OLP的“疾病-活性成分-靶點”網絡圖，其中“節點”分別代表活性成分和靶蛋白，“邊”代表成分與靶點之間的作用關系。

1.4 靶蛋白相互作用 ( protein-protein interaction，PPI) 網絡的構建

在STRING version 11.0平臺構建靶蛋白相互作用( protein-protein interaction，PPI) 網絡。物種設為“Homo sapiens”(人類) ，最低相互作用閾值設為中等置信度“medium confidence”0.4，其余參數保持默認設置[9]。將得到的基因數據導入Cytoscape 3.6.1，進行Network Analysis分析。

1.5 基因本體論(GO)生物過程和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

運用R語言將復方絞股藍膠囊作用于OLP的靶點轉化成entrez ID；使用clusterProfiler包對其進行數據處理和可視化處理，得到GO和KEGG富集分析的柱狀圖、氣泡圖、通路圖及含有P值的數據。柱狀圖和氣泡圖僅顯示P值最小的前20個功能或通路；最后用Perl將轉化的entrez ID轉變為原始的基因靶點。

1.6 分子對接

將復方絞股藍膠囊的主要活性成分與預測的OLP主要靶點進行分子對接。使用ChemBio3D獲得復方絞股藍膠囊活性成分的3D結構，并使用AutoDock軟件進行加氫、加電子等操作，觀察可扭轉的化學鍵個數。從RCSB數據庫(https://www.rcsb.org/)下載靶蛋白的結構，使用Pymol軟件去除溶劑分子與配體，使用AutoDock軟件進行加氫、加電子等操作。完成后使用AutoDock Vina進行半柔性分子對接，對對接結果進行分析處理。

2 結果

2.1 復方絞股藍膠囊治療 OLP的主要活性成分篩選

利用TCMSP數據庫對絞股藍進行挖掘，共收集到203個化學成分，根據OB>30%， DL>0.18的原則，得到24個活性成分，再加上燈盞花素(scutellarin)，共25個活性成分。

2.2 復方絞股藍膠囊活性成分作用于OLP的靶點預測與篩選

通過Genecards數據庫和OMIM數據庫挖掘到OLP相關靶基因 365個，將其與TCMSP、Swiss Target Predicition預測得到的204個藥物作用靶基因映射，得到54個共同靶基因。將數據導入Cytoscape 3.6.1軟件，構建復方絞股藍膠囊治療OLP的“疾病-活性成分-靶點”網絡圖(圖1)。共篩選出15個復方絞股藍膠囊作用于OLP的活性成分，如表1所示，其中11個成分為皂苷類化合物，其作用靶點大致相同，如Gypenoside LXXIV、Gypenoside LXXIX和Gypenoside XXXII均作用于HPSE、FGF2、VEGFA、BCL2L1和IL2 等5個靶點。燈盞乙素、鼠李秦素和槲皮素均為黃酮類成分，其中槲皮素的作用靶點數最多，為49個。從作用靶點的角度分析，白細胞介素-2(IL-2，節點連接度=8)擁有最多相互作用的配體，其次是前列腺素內過氧化物合酶2(PTGS2，節點連接度=8)、血管內皮生長因子A(VEGFA，節點連接度=7)、乙酰肝素酶(HPSE，節點連接度=6)，成纖維細胞生長因子2(FGF2，節點連接度=6)和促生存因子(BCL2L1，節點連接度=6)。這表明他們是復方絞股藍膠囊治療OLP作用的主要靶點。15個活性成分共作用于54個靶蛋白發揮OLP治療作用，體現了復方絞股藍多組分、多靶點的作用機制。

圖1 復方絞股藍膠囊治療OLP疾病-活性成分-靶點網絡圖Figure 1 Disease-active component-target network of compound Jiaogulan capsule in the treatment of OLP

表1 復方絞股藍膠囊作用于OLP主要活性成分信息Table 1 Information on the main active components of compound Jiaogulan capsule in OLP

2.3 PPI網絡分析

采用STRING version 11.0網絡平臺對篩選出的復方絞股藍膠囊治療OLP靶點進行PPI分析，將PPI得分大于0.4的基因數據導入cytoscape 3.6.1 軟件進行Network Analysis分析，靶蛋白PPI網絡圖如圖2所示。靶點的度值和介數中心數越大，說明靶點越處于PPI網絡中心，越能發揮關鍵作用。靶點圓越大，表明度值越大；顏色越接近橙色，表明介數中心數越大。度值和介數中心數均較大的排名前10靶點名稱、Uniprot ID號、度值和介數中心數見表2所示。

表2 復方絞股藍膠囊治療OLP靶蛋白PPI網絡中的關鍵靶點及其拓撲參數Table 2 Key targets and topological parameters in PPI network of target protein of compound Jiaogulan capsule in the treatment of OLP

圖2 復方絞股藍膠囊治療OLP靶蛋白的PPI網絡圖Figure 2 PPI network of compound Jiaogulan capsule in the treatment of OLP

2.4 GO功能富集分析

將預測得到的54個作用靶點通過基于R語言的clusterProfiler進行GO富集分析。共獲得62個功能，前20個功能的GO功能富集的柱狀圖，如圖3a所示。橫坐標表示靶點數，左邊表示富集的功能，P值由顏色表示，值越小越偏向紅色，反之偏向藍色。富集靶點較多的功能包括細胞因子活性(cytokine activity)、細胞因子受體結合(cytokine receptor binding)和受體配體活性(receptor ligand activity)等。

2.5 KEGG通路富集分析

通過KEGG分析復方絞股藍膠囊治療OLP預測靶點的通路分布，結果共有14條KEGG代謝通路參與其中，如圖3b所示，主要涉及內分泌抵抗(endocrine resistance)、絲裂原活化蛋白激酶信號通路(MAPK signaling pathway)、低氧誘導因子1信號通路(HIF-1 signaling pathway)、細胞因子-細胞因子受體相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction) 和EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥 (EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)等。由此可見，復方絞股藍膠囊通過調節多條代謝通路共同發揮治療OLP的作用。

a. GO富集分析； b. KEGG通路富集分析。

2.6 復方絞股藍膠囊活性成分與靶蛋白分子對接結果

將篩選出的復方絞股藍膠囊中的15個活性成分與排名前4的靶點VEGFA、IL6、AKT1和EGF進行分子對接，選取打分最高(affinity數值最低)的構象作為對接構象，并利用pymol程序對其進行可視化分析[10]。每種活性成分產生10種對接結果，結合能越小說明受體與配體之間的親和力越大，因而選取結合能較低且構象較好的結果作為分子對接結果。所有成分與靶點的結合能均小于-5 kcal/mol，如表3所示。Scutellarin、Gypenoside XII、ginsenoside f2和Gypentonoside A_qt與4種靶蛋白對接的平均結合能值最低，其典型對接結果如圖4所示。

a. scutellarin與VEGFA; b. Gypenoside XII與IL6; c. ginsenoside f2與AKT1；d. Gypentonoside A_qt與EGF。

表3 復方絞股藍膠囊治療OLP的4個重要靶點的分子對接Table 3 Molecular docking of four important targets of compound Jiaogulan capsule in the treatment of OLP

3 討論

OLP的病因和發病機制目前仍不明確，目前大多數研究認為該病與免疫反應的異常有關。以往研究證實細胞因子、生長因子、細胞黏附分子、基質金屬蛋白酶等均參與了病損局部的炎癥和免疫反應，在介導這一異常的免疫反應中起著主要作用[11-14]。通過PPI網絡分析，推測出復方絞股藍膠囊治療OLP的主要靶點，包括VEGFA、IL6、AKT1、EGF和MMP-9等。VEGFA是目前發現的最有效的血管生成促進因子之一，影響內皮細胞的血管通透性、增殖和活力；基質金屬蛋白酶-9 (MMP-9)是明膠酶的一種，能分解某些組織中的結構復合物，還能調節其他蛋白酶及細胞因子的活性，其可通過釋放血管內皮生長因子(VEGF)參與血管生成，VEGF和MMP-9在單純的OLP或者異常增生的OLP中都有相應的增高表達[15-16]。IL-6是一種具有廣泛免疫調節活性的細胞因子，已有多項研究表明，其在OLP患者的血清和唾液中具有較健康人升高的表達，在OLP發病機制中可能起到較為關鍵的作用[17-18]。AKT是PI3K的下游靶標，活化后的AKT蛋白將其底物磷酸化，成為很好的細胞存活因子，進而能使細胞進入分裂周期，促進細胞生長并抑制其凋亡，這大大增加了細胞癌變的幾率，AKT因此也被認為是一種原癌基因[19-20]。表皮生長因子(EGF)是一種強有力的角質形成細胞分裂劑，通過表皮生長因子受體(EGFR)介導對多種組織細胞具有促進增殖作用，EGF和EGFR蛋白表達在OLP向口腔鱗狀細胞癌(OSCC)的轉變中作為OSCC早期診斷的客觀指標之一[21]。

GO功能富集結果顯示，復方絞股藍治療OLP的潛在作用機制多集中在調節細胞因子活性、細胞因子受體結合和受體配體活性等。KEGG通路富集分析排名前5位的信號通路分別為內分泌抵抗、絲裂原活化蛋白激酶信號通路、低氧誘導因子1信號通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用和EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥。OLP多發于中老年女性，內分泌及代謝紊亂是OLP發生的獨立危險因素[22]。另有研究表明，情緒及社會心理因素導致的神經內分泌紊亂與OLP的發生有關[23]。內分泌抵抗與多條致癌信號通路相關，包括表皮生長因子受體、成纖維細胞生長因子受體PI3K/AKT/mTOR、MAPK/ERK和CDK4/CDK6等[14]。MAPK信號通路是炎癥性疾病的關鍵通路，可將細胞外的信號(如應激、生長因子等)傳遞至細胞內，影響腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)、環氧酶2(COX2)等炎性因子的生成，并參與調控細胞的增殖、分化及凋亡[24]。缺氧微環境在免疫炎性疾病發生發展中的重要性備受關注，HIF-1是缺氧誘導的轉錄激活因子，是氧穩態和生理反應的調節因子[25]。Westendorf 等[26]在HIF-1α基因缺乏的T淋巴細胞發現促進核心炎癥因子NF-κB的過表達；Chang等[27]研究表明MMP-9是HIF-1α的下游因子之一，據此推測缺氧微環境HIF-1α/MMP-9信號通路參與OLP基底細胞液化變性。細胞因子和細胞因子受體相互作用網絡被認為是炎癥和腫瘤免疫學的關鍵方面[28]，復方絞股藍活性成分通過IL10、IL6、IL-1β、CCL2和IL-8等多種細胞因子調控細胞因子-受體相互作用，降低炎癥反應。

本研究運用網絡藥理學結合分子對接的方法，發現復方絞股藍膠囊中的11個皂苷類成分、燈盞乙素、槲皮素及鼠李素可能是其治療OLP的潛在核心化合物。絞股藍多個成分可能通過上述多個靶點協同發揮抗OLP效果，具有良好的開發前景。