基于基質輔助激光解吸電離質譜成像技術對高血脂模型大鼠腦部脂質變化的研究

梅穎，胡輝，鄶一賀，譚文

(廣東工業大學生物醫藥研究院，廣東 廣州 510006)

質譜成像是指將質譜檢測與病理圖像相結合，應用于解析樣品表面多種分子化學組成及各組分的空間立體結構信息的一種新型分子影像技術，該技術具有較高的靈敏度和較寬的質量檢測范圍，尤其在檢測組織中脂類等小分子的優勢明顯。

基質輔助激光解吸電離質譜(MADLI-MSI)最先由美國科學家 Caprioli等[1]提出。通過選擇合適的基質將 MADLI-MSI 噴灑在組織切片的表面上，并通過激光照射使樣品與基質形成共晶，基質從激光吸收能量而將其傳遞給生物分子[2]。生物分子隨后被電離，離子在電場的作用下陸續飛過飛行管，并根據到達探測器的飛行時間進行各個離子的檢測。同時待測離子的質荷比與離子的飛行時間成比例。質譜軟件根據切片的大小將圖像劃分為由若干點組成的二維晶格，并且計算機虛擬掃描質譜數據以形成組織的二維離子密度圖像。將每個點處的質譜數據進行歸一化處理以獲得表示該區域中化合物分布的質譜圖。最后由所有數據集可獲得組織切片的化學成分和空間分布信息[3]。化合物的相對豐度由峰高或峰面積表示，相對豐度由亮度強度或不同顏色圖案表示。此技術經過不斷的發展，目前可實現從蛋白質[4]、多肽[5]等生物大分子到脂類[6]等中分子量生物分子和小分子藥物的分析[7]， 雖然在國外該技術已被廣泛應用于生物科學研究的許多領域但在國內由于儀器設備的限制，用該技術研究并不常見。

脂質組學是對生物體中的細胞、組織和器官相互作用的脂質和分子的全面和系統的分析。多種研究表明脂質與各種疾病的發生發展密切相關，但由于脂質分子結構的多樣性和復雜性，想要探究脂質的結構和功能，進一步了解脂質與人體病理學和生理學的關系顯得相當困難。 近幾年在脂質組學領域應用高分辨率質譜技術能夠快速、高通量地分析各種生物脂質成分，進行大規模的整體脂質組學分析。

本研究運用MADLI-MSI質譜成像技術，對大鼠高血脂造模后的腦組織標本進行了分析，目的尋找能夠闡述病變過程的潛在生物分子以及高脂模型中的可能脂質改變，并進一步通過生物分子之間可能的內在相關性進行探討，闡述并發現潛在標志物分子的生物學意義并為其他類似研究提供新的實驗方法。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性SD大鼠，SPF級，體質量100～120 g,周齡5～6周。購于南方醫科大學動物實驗中心，生產許可證號SCXK(粵)2016-0041。高脂高膽固醇飼料購于北京博宏達生物科技有限公司。

實驗試劑：基質 DHB、9-AA購于美國Sigma公司；甲醇、乙醇、聚丙烯胺標準品購于Fisher公司；三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、游離脂肪酸(FFA)檢測試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

1.2 主要儀器和儀器參數

1.2.1 實驗儀器 US 2016/0278400A1 image PreP噴灑(德國Bruker)；rapifle X MADLI-TOF/(德國Bruker)； Enspire酶標儀(鉑金埃爾墨公司)。

1.2.2 儀器參數 MADLI-IMS 測定條件：(1)正離子模式：質譜采集范圍為600～1 200；采集模式為反射模式；分辨率為50 μm； 激光光斑數為 300/pixel；激光聚焦設置為 M5 small；離子源 1 電壓為 20 kV； 反射器 1 電壓為 20.9 kV；反射器 2 電壓為 1.085 kV；反射器 3 電壓為 8.6 kV； 透鏡電壓為 11.6 kV。(2)負離子模式：質譜采集范圍為600～1 200；采集模式為反射模式；分辨率為50 μm； 激光光斑數為 500/pixel；激光聚焦設置為 M5 small；離子源 1 電壓為 20 kV； 反射器 1 電壓為 20.9 kV；反射器 2 電壓為 1.085 kV；反射器 3 電壓為 8.6 kV； 透鏡電壓為 11.6 kV。

1.3 方法

1.3.1 大鼠高血脂模型的建立和取材 SD大鼠在進入動物實驗室后適應性喂養1周， 在適應性喂養期間對其進行觀察，若出現厭食、體質量明顯下降情況，及時剔除問題大鼠，不進行建模試驗。7 d適應性喂養結束后，隨機挑取24只分為正常組12只，高脂模型組(HFD)12只。 模型組大鼠進行高脂飼料喂養5周，飼料的配方為：豬油 10% ，蛋黃粉5%，膽固醇 2%，三號膽鹽0.5%，維持底料 82.5%。5周后禁食不禁水12 h采用眼靜脈叢采血。分離血清測定血清中TG、TC等血脂含量，若血脂顯著高于正常組大鼠說明高脂建模成功可以進行下一步試驗。取成模后的大鼠繼續喂養5周，其飼料配方為：豬油 10% ，蛋黃粉5%，三號膽鹽0.5%，維持底料 82.5%。到第10周時，采血，分離血清測定TG、TC等血脂含量，采用摘眼球法在鼠的右側眼球根部摘去眼球收取血液安樂死動物，用左手持鉤鑷插入大鼠的眼眶固定顱骨，后用彎鉗直接夾住枕骨大孔處的骨頭，直接就掀起取出腦組織冷凍、切片，進行質譜成像實驗。

1.3.2 生化指標的檢測 參照試劑盒說明書測定TG、 FFA、TC 水平。

1.3.3 腦組織切片的制作 將腦組織從冰箱取出后，移入切片機內，放置 20 min，然后在冷凍切片機中進行冰凍切片。將每例標本在手動模式下切出厚度為 10 μm 的切片用于 MADLI-MSI 成像，可將切片儲存于超低溫冰箱備用。

1.3.4 樣本組織預處理 將冰凍的切片置于真空干燥器中，干燥大約 30 min，待切片表面無明顯的水份即可用于下一步實驗。在玻片上做好標記，用紙片將標記遮住，待成像時這些標記可用于坐標定位。將 30 mg/mL 的 DHB 溶液使用 Image Prep 噴灑儀將基質溶液噴灑到組織片上，以此作為采集正離子信號的樣本；將 10 mg/mL的9-AA 溶液使用 Image Prep 噴灑到組織片上，作為采集負離子信號的樣本。由于采集的主要是脂類分子的信號，而在此條件下，脂類分子的相對豐度較高，故腦組織可不用作其他的預處理。

1.3.5 質譜成像數據的采集 切片采用 MADLI-MSI 進行成像處理分析。MADLI-MSI 成像時，在正、負離子檢測模式下采集質譜數據，采用全掃描模式，掃描范圍設定在 600～1 200；數據采集分別釆用了數據處理系統及儀器控制及數據處理系統。在數據采集前，需要對切片進行噴基質處理，然后將切片送入質譜儀，隨后用標準品進行校正，并調整激光能量，使所采集質譜峰的分辨率達到 10 000，質譜峰信號強度達到 104級別，待方法達到要求后可保存該方法用于組織成像數據的采集，然后在組織成像軟件中設置要采集的切片位置和范圍，最后開始采集樣品表面組織的質譜信號。

1.3.6 質譜成像分析與數據處理 數據處理過程包括分割分析、多變量統計分析和 ROC 分析等幾個過程。首先檢測獲得原始質譜數據，將數據文件(.mis 格式)轉換成為數據分析格式(.sl 格式)，之后將格式的文件采用成像軟件 SCiLS Lab 批量處理,進行上述的分割分析、多變量統計分析和 ROC 分析并輸出。

1.3.7 統計學處理 采用GraphPad Prism 5統計學軟件,組間差異采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 高血脂模型的評價

高血脂模型組與正常組比較， FFA、TC、TG 水平顯著升高，差異均有統計學意義，表明大鼠高血脂模型建立成功。見表1。

表1 血清中TC、TG、 FFA的含量Table 1 Contents of TG,TC and FFA in serum c/(mmol·L-1)

2.2 高血脂模型腦組織切片 MADLI-MSI 成像數據分析

結果見圖1。高血脂模型組的腦組織與正常組相比，未見明顯的差別。利用 SCiLS lab 軟件進行分割分析，選擇整片腦作為感興趣的分析區域，結果發現兩者的結果不管是在正離子(Positive ion mode)或者負離子模式(Negative ion mode)下，正常組和高血脂模型組均未見到明顯的特征差異。

圖1 大鼠腦片正常組和高血脂組MADLI-MSI 成像分割分析結果Figure 1 Results of MADLI-MSI image segmentation analysis

2.3 腦切片主成份分析(PCA 分析)

從圖2可以看出兩者在分布行為上相似，通過 PCA 分析不能將兩組分開，故沒有差異分子使兩組數據產生差異。

A.正常組腦組織切片平均質譜圖； B.高血脂組腦組織切片平均質譜圖。

3 討論

本實驗通過采用 MADLI-MSI 質譜成像技術對實驗動物疾病模型的腦組織進行了質譜成像和數據分析，主要內容包括正負離子檢測模式下獲得高血脂模型腦組織切片中的脂類分子信息，通過成像軟件選取各標本中的感興趣區域，對各切片數據進行分析，并進行PCA分析研究。通過對腦組織切片進行分組對比，探究與疾病病理進程和藥物干預相關的差異分子信息。

對高血脂大鼠模型的腦組織分析結果表明在給予高脂喂食后，腦部的脂類分布未見顯著的改變，說明在高脂誘導大鼠10周時其外周血液里的高血脂水平并不會影響到腦部脂類的分布改變，而Kothari 等[8]研究表明，高脂喂養14周C57BL/6NHsd 小鼠，發現小鼠腦部受損出現認知功能障礙。另外，最近也有類似文獻報道，高脂喂養小鼠19周后通過GC-MS分析腦部脂質的分布發現有明顯的變化[9]。分析原因可能是目前本研究的工作只是對10周高血脂大鼠進行腦片掃描分析，誘導周期短沒有達到腦部損傷程度。具體如何后續工作還有待進一步研究。

本文研究結果為臨床腦部研究提供了一定的理論依據，同時本文采用前沿MADLI-MSI質譜成像技術方法也為其他類似研究提供借鑒意義。