基于GEO數據庫的DPN相關靶點挖掘及與芍藥苷分子對接研究

陳佳，李偉，劉征，江雅琴，邢琪昌

(湘潭市中心醫院藥學部，湖南 湘潭 411100)

糖尿病周圍神經病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)的發病機制復雜，涉及多個靶點和通路，臨床上單一的對癥治療通常難以達到理想效果。隨著基因芯片技術和高通量測序技術的快速發展，基因數據大量累積，從中篩選出與DPN發生發展相關的關鍵基因，或許能夠為DPN的后續研究和新藥研發提供重要依據。芍藥苷為中藥白芍、赤芍、牡丹皮等主要活性成分，現代藥理學研究表明芍藥苷具有改善胰島素抵抗、抗氧化、減輕神經炎癥和疼痛等功效[1]。本研究擬利用基因表達綜合數據庫(Gene Expression Omnibus，GEO)對DPN發生發展相關的關鍵基因和相關通路深入挖掘，并通過AutoDock VINA分子對接工具測定芍藥苷與關鍵靶點蛋白的親和力，從而試圖闡明芍藥苷在治療DPN上具有潛在的研究和開發價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象

從GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中查找DPN人群研究的mRNA基因芯片(檢索詞為diabetic peripheral neuropathy，物種限定為人，標本為外周血)，將糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者和DPN患者外周血對比芯片GSE95849(12 samples，基于Phalanx Human lncRNA OneArray v1_mRNA，GPL22448平臺)納入分析范圍。

1.2 方法

1.2.1 差異基因選取 參考文獻[2]方法，在GEO2R平臺內(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r /acc=GSE95849)，將樣本進行分組，對兩組數據做差異mRNA基因分析，按自動設計方案選出每個芯片中表達差異明顯的基因，剔除|Log2 Fold Chang|<2、P>0.05，以及信息不完整的基因數據。

1.2.2 蛋白相互作用網絡構建 將篩選出的差異基因導入STRING在線數據庫(https://string-db.org/)，獲得差異基因所編碼的蛋白質之間的相互作用，統計分析各個靶點的edge數，edge數越大越處于網絡核心。

1.2.3 基于AutoDock VINA的分子對接 為了預測和驗證DPN候選靶點與芍藥苷化合物的結合親和力，采用Autodock Vina 1.0為分子對接引擎，經殷賦云計算平臺(http://www.yinfotek.com/platform)完成分子對接，用對接分數(Infinity)來評估結合親和力。一般認為Infinity<-4.0則化合物與靶點蛋白具有較強親和力。

1.2.4 體外驗證試驗 取濃度為2×106cells/mL的WEHI 274.1(小鼠單核細胞系，ATCC)的細胞混懸液1.0 mL于六孔板中，分別加入空白溶液和不同濃度芍藥苷溶液作用30 min，隨后加入mCCL2(30 nmol/L，R&D Systems)反應，5 min后撤去上清液，用預冷PBS清洗3遍，隨后加入預冷含蛋白酶/磷酸酶抑制劑的RIPA溶液，冰上裂解10 min，離心(13 000 r/min，4 ℃，10 min)，收集上清液；Western實驗中取15 μL上述上清液，加15 μL上樣緩沖液(2×)，煮沸5 min，配置10% Tris-Glycine分離膠并上樣，電泳，轉模，封閉膜用TBST清洗后孵一抗(p38-MAPK，pp38-MAPK)(1∶1 000，CST)，孵育過夜后洗滌，孵二抗，顯影。

2 結果

2.1 差異基因篩選結果

經過對比DM組和DPN組基因表達情況，共篩選出DPN相對于DM高表達基因71個，低表達基因61個，共計132個，其分布見圖1。

注：紅色代表上調，綠色代表下調。

2.2 蛋白相互作用網絡

上調差異基因編碼蛋白相互作用網絡，見圖2A，CC趨化因子受體2(CC chemokine receptor 2，CCR2)edge數為5，即與另外5個靶點存在相互作用關系，在該網絡中具有更重要的作用，因此將CCR2定為核心靶點；下調差異基因編碼蛋白相互作用網絡，見圖2B，腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)edge數為4，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)edge數為6，同樣定為核心靶點。

注：A.上調差異基因； B.下調差異基因；節點之間連線的粗細代表其互作關系的數據支持程度，連接線越粗代表支持數據越多；不同顏色代表蛋白的不同類別。

2.3 AutoDock VINA分子對接結果

圖3是芍藥苷與CCR2、TNF和BDNF的對接整體圖，Infinity分別為-8.0、-5.2和-5.0，表明芍藥苷與該3個靶點蛋白具有較好的親和性。

A.芍藥苷-CCR2； B.芍藥苷-TNF； C.芍藥苷-BDNF。

2.4 體外驗證試驗結果

選取分子對接結果中結合能最低的CCR2靶點為驗證對象，MAPK信號通路已被證明在CCR2及其配體相互作用時被激活[3]，并且CCL2/CCR2參與了神經病理性疼痛[4]，本研究考察不同濃度芍藥苷對mCCL2激活的CCR2/MAPK的影響，結果顯示mCCL2和芍藥苷對p38總表達量無顯著影響，而mCCL2能夠激活p38磷酸化，推測芍藥苷對p38的磷酸化具有抑制作用。見圖4。

圖4 芍藥苷抑制WEHI 274.1細胞經mCCL2刺激的p38磷酸化Figure 4 The phosphorylation of p38 inhibited by Paeoniflorin in WEHI 274.1 cells stimulated by mCCL2

3 討論

DPN是糖尿病常見并發癥之一，其發病機制復雜，過去幾十年對 DPN發病機制的研究著重于代謝通路，認為由高血糖癥引發的代謝通路改變了細胞內代謝及氧化還原反應，包括多元醇通路、己糖胺通路、蛋白激酶 C通路及糖基化終末產物堆積等；近幾年，出現了一些新的機制，包括脂代謝、生長因子、胰島素抵抗及神經營養不足等[5-6]。目前，臨床上對 DPN 的治療仍以控制血糖和對癥治療為主，尚無逆轉 DPN 進展的治療方法。本研究借助于生物信息學方法，在GEO數據庫中檢索DPN相關基因芯片，獲取6名DPN患者和6名糖尿病對照患者基因數據進行對比和分析，發現差異基因132個，其中上調基因71個，下調基因61個，隨后通過構建差異基因對應蛋白相互作用網絡，分析確定CCR2、BDNF和TNF處于網絡核心，這些基因可能成為DPN的診斷和治療指標。

DPN的發病機制雖尚未闡明，但其病理特征是雪旺細胞和有髓神經纖維的退化以及位于背根神經節的神經元群的喪失[7-8]。雪旺細胞合成分泌功能異常導致的局部神經營養因子不足可能是DPN發生的機制之一。

BDNF屬于神經營養因子家族，是一類與神經細胞發育、分化、生長、再生和功能有重要調控作用的蛋白[9]。BDNF對外周神經損傷后神經元的存活及軸突再生有重要意義，失去內源性BDNF的作用可影響軸突生長和髓鞘化，而局部注射BDNF可以促進神經的再生[10-11]；同時BDNF也是誘發神經病理性疼痛的重要啟動因子之一，在多種疼痛動物模型中都可以見到BDNF在背根神經節和脊髓中表達上調，阻斷BDNF的作用能有效抑制多種疼痛模型產生的痛覺過敏現象。

TNF是由活化的單核細胞和(或)巨噬細胞產生的一種細胞因子，具有選擇殺傷某些腫瘤細胞功能和多種免疫調節作用，尤其在炎癥反應中發揮重大作用。正常情況下，血漿中的TNF-α水平較低，但對于維持內環境穩定具有重要作用[12]。有研究發現繼發病理性疼痛的發生與TNF水平具有一定關系，TNF水平升高可能是外周神經損傷患者繼發病理性疼痛的一個危險因素[13]。趨化因子受體結構是一個7次跨膜的多肽鏈，含有具有酸性的N-末端胞外結果域和富含絲氨酸/蘇氨酸的胞內C-末端。趨化因子受體激活不同的信號通路，如絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)通路、磷脂酶C通路(phosphlipase C，PLC)等，導致不同的功能結果，包括黏附、極化和趨化等[14]。

CCR2 是趨化因子單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)的高親和性受體，受體與配體結合后，趨化控制單核細胞，參與單核細胞介導的炎性反應[15]。有研究表明[16]，在炎性疼痛模型中，MCP-1及其受體CCR2 在背根神經節中的表達明顯升高，應用CCR2阻斷劑可以很大程度逆轉機械痛覺過敏反應[17]。

芍藥苷屬于單萜糖苷類化合物，具有獨特的橋頭氧壓葡萄糖和高度氧化的籠狀蒎烷(藻烷)骨架，于1963年從芍藥中分離得到，目前對于芍藥苷抗抑郁、抗炎鎮痛、抗腫瘤、調節免疫、保肝、保護神經、抗糖尿病并發癥等藥理作用的研究較為深入，提示將其開發為有效的藥物有一定的可能性[18]。在神經保護方面，芍藥苷可能通過作用于腺苷受體、M膽堿受體、阿片受體、Ca2+通道、NF-κB等途徑發揮對神經退行性疾病、腦缺血損傷、疼痛、突觸可塑性損傷和神經細胞損傷等的保護或治療作用。有報道稱芍藥苷緩解炎癥的作用與其抑制單核巨噬細胞系統釋放TNF等促炎因子有關[19]，芍藥苷緩解慢性炎癥疼痛可通過抑制炎癥因子釋放，也通過抑制脊髓小膠質細胞的激活，而此過程依賴抑制 Akt-NF-κB 信號的激活[20]；也有實驗證明芍藥苷能夠有效促進高糖培養的雪旺細胞的增殖能力、上調神經生長因子基因與蛋白的表達，從而保護雪旺細胞、改善周圍神經的形態和功能[21]。本研究表明芍藥苷與DPN核心靶點BDNF、TNF、CCR2結合良好，能夠抑制WEHI 274.1細胞經趨化因子CCL2激活引起的p38磷酸化，為進一步研究芍藥苷修復神經、抗炎止痛等作用機制奠定基礎。