益腎泄濁法對糖尿病腎病大鼠Col IV、FN蛋白及基因表達的影響

邵燕燕，鄭曉靜，薛化成，梁祎，甘旗旗，焦畔畔

(西安市中醫醫院腎病科，陜西 西安 710021)

糖尿病常常伴有糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)的發生，而且DN會導致終末期腎病的發生[1-3]。根據國際糖尿病聯合會的統計，到2030年，DM的數量將繼續增長，中印兩國的增長幅度更大。糖尿病有將近35%的患者死于尿毒癥，而糖尿病腎病的發生率也有將近1/4左右，因此需要急切找到防治DN的辦法。

中醫藥理論認為，DN主要病機為氣陰不足，脾腎兩虛，瘀血阻絡，濕濁不化，臨證多采用益氣養陰，健脾補腎，化瘀瀉濁的基本治法。 “三消一證，……其實不越陰虧陽亢，津涸熱淫而已”，陰虛熱盛后，灼津傷精，濁瘀滯結，消渴則發，瘀氣聚眼則發眼疾，擾亂心臟。“五臟之傷，窮必及腎”[4-6]。陶興等[7]認為，瘀血聚體，病及腎臟。腎臟是胃的關鍵，腎氣受損，必殃及胃。消渴日久，必害其腎，精氣下泄，濁毒及發。

臨床上多采用益氣養陰、健脾補腎、泄濁化瘀的方法來治療糖尿病腎病。益腎泄濁法標本兼治，臨床應用多年，具有緩解癥狀，降低血糖、血脂、延緩DN病變等優勢和特色。為了明確益腎泄濁法防治大鼠DN的生物學機制，本課題組擬探討其與大鼠膠原蛋白Ⅳ(Col Ⅳ)、纖維粘連蛋白(FN)和基因[8]表達的關系，以期揭示其作用規律并為中醫藥防治DN的分子生物學機制研究提供新思路。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠購于西安交通大學實驗中心，體質量180～220 g，生產許可證號SCXK (陜) 2017-003。

1.2 藥物與試劑

按照藥典規定購買益腎泄濁法相關藥材(黃芪、丹參、益母草、女貞子、旱蓮草、茯苓、豬苓、芡實、地龍等)，經西安交通大學藥學院竇建衛副教授鑒定為正品；RNA逆轉錄試劑盒(北京康潤誠業生物科技有限公司，批號8BC01)；鏈脲佐菌素(STZ)、抗體、Collagen Ⅳ、FN、β-肌動蛋白(美國細胞信號技術公司)。

1.3 主要儀器

CFX ConnectTM型Real-time PCR儀(美國Bio-Rad公司)； Centrifuge 5424R型冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；PowerPacTM型電泳儀電源、Trans-blot型轉印槽、Genegnome XRQ型專業化學發光成像系統(中國基因有限公司)；DS-11型超微量分光光度計(中國倍輝科技有限公司)；ECLIPSE Ts2型倒置顯微鏡(日本尼康公司)。

2 方法

2.1 藥液制備

黃芪60 g，丹參25 g，地黃和女貞子各20 g，丹皮、地龍和澤瀉各10 g混合組成處方，將處方內容制備成質量濃度為0.9 g生藥/mL的劑量進行實驗。

2.2 大鼠DM模型的建立與分組

實驗前，所有大鼠禁食12 h，自由飲水。大鼠在無菌條件下，按照60 mg/kg的劑量在右下腹部注射STZ，以誘導DM，用檸檬酸緩沖液處理空白對照。30 min后進食，72 h后，從尾部收集血液測量血糖。隨機血糖大于16.7 mmol/L，飲用水的量和排尿量顯著增加則表示造模成功[9-11]。造模前按體質量排序隨機分為空白對照組(Con)，將造模成功的大鼠按血糖排序并編號，以使各造模組血糖值差異無統計學意義，采用分層隨機分組法分為：模型組(DM)、陽性藥物對照組(氨基胍組，AG)、益腎泄濁法組方高劑量組(SQC-H)、中劑量組(SQC-M)、低劑量組(SQC-L)，每組各10只，各組隨機編為1～10號并做相應標記。造模成功1周后，開始給藥。SQC-H組、SQC-M組、SQC-L組分別按6 g生藥/kg、3 g生藥/kg和1.5 g生藥/kg給予益腎泄濁法組方藥液，Con組和DM組則每千克給予20 mL蒸餾水，每天上午8～9點進行灌胃，持續16周；陽性藥物組給予氨基胍3 g /kg。

2.3 生化檢查

收集大鼠尿液和血液檢測血尿素氮(BUN)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、24 h尿蛋白(Alb)、血肌酐(Scr)。

2.4 光鏡檢查

蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染色后進行光鏡檢查[12]。

2.5 Western blot檢測Col IV、FN蛋白表達

處死大鼠前，禁食12 h，麻醉，切除左腎，稱質量并儲存于液氮中，按照蛋白質提取試劑盒說明提取蛋白。電泳每孔上樣20 μg，轉膜、封閉、放過夜。次日，加入一抗(1∶1 000)，孵育2 h，洗滌5次，再加入二抗，室溫孵育2 h，添加ECL發光溶液，參照蛋白為β-actin蛋白。

2.6 Real-time PCR檢測Col IV、FN mRNA表達

處死大鼠前，禁食12 h，麻醉，切除左腎，稱質量并儲存于液氮中，再提取總RNA，使其純度符合要求。逆轉錄時加入1 μg的RNA樣品、5×Primer Script RT Master Mix無RNase水至10 μL，輕輕搖動使其均勻混合，進行反應。37 ℃下反應15 min，反應后的產物cDNA儲存在-20 ℃的冰箱中。

2.7 統計學方法

3 結果

3.1 各組大鼠腎功能相關生化指標的變化

表1所示，與Con組相比， DM組BUN、HbA1c、Alb、Scr顯著升高(P<0.05)。與DM組比較，SQC高、中、低劑量組的HbA1c明顯降低(P<0.01)，SQC-H組能顯著抑制BUN、Scr、尿蛋白的升高(P<0.05)，而SQC-L組作用不顯著(P>0.05)。

表1 各組生化指標的變化Table 1 Changes of biochemical indexes in each group

3.2 各組HE染色結果

結果見圖1。Con組腎小球結構清晰，無擴大和萎縮，腎小管管壁無塌陷、無增厚，系膜細胞無增生現象；DM組部分腎小球明顯增大，產生更厚的腎小囊壁和更多的系膜細胞，腎管狀上皮細胞產生空泡樣的病變；與DM組相比，SQC組腎小球趨于正常，但系膜區仍變大，細胞數量增加，體積明顯減小，SQC-H組的結構接近正常。

A. Con組； B. DM組； C. SQC-H組； D. SQC-L組。

3.3 各組大鼠腎皮質中Col IV、FN蛋白的表達結果

如圖2、圖3所示，參照β-actin蛋白條帶的大小和顏色深淺，并與模型組相比，益腎泄濁法高、中、低劑量組的條帶較小，顏色淺，表明益腎泄濁法能使糖尿病腎病大鼠Col IV、FN蛋白表達減少。

1. Con組； 2. DM組； 3. AG組； 4. SQC-H組； 5. SQC-M組； 6. SQC-L組。

與Con組比較：#P<0.05；與模型組比較：*P<0.05。

3.4 各組大鼠腎皮質中Col IV、FN mRNA的表達結果

如圖4所示，與模型組相比，益腎泄濁法高、中、低劑量組mRNA相對表達量較低，高劑量組最顯著，表明益腎泄濁法能減少糖尿病腎病大鼠Col IV、FN mRNA的表達。

與Con組比較：#P<0.05；與模型組比較：*P<0.05。

4 討論

中醫學上認為陰虛和燥熱常常會引發糖尿病腎病，特別是陰虛。陰虛則熱盛，二者因果并存，消渴日久，陰虛則損陽，陽虛則致寒，血液流淌不暢，瘀血阻滯，即“瘀血化水，亦發水腫，是血病兼水病也”。消渴日久，則為水腫[7]。長期患病會傷及腎，脾腎虛弱則使氣不調。因此，在DN的臨床治療中，疾病分化應與綜合征分化相結合，通過益腎和凈化濁度為關鍵。

益腎泄濁法組方由黃芪、丹參、益母草、女貞子、旱蓮草、茯苓、豬苓、芡實、地龍等藥物組成，方中黃芪兼具益氣補腎、利水化濁之功，與DN脾腎氣虛、濕濁阻滯之機契合，故為君藥；丹參和益母草組合使用，可以消除血液停滯和激活血液循環，促進利尿，還能消腫；女貞子、旱蓮草、茯苓、豬苓、芡實合用，補益肝腎，健運脾胃，活血利水，是為佐藥；地龍能利小便而助泄濁、通經絡而助祛瘀，瘀濁內蘊，久易化熱，性咸寒又可清熱解毒，是為使藥。全方共奏健脾益腎、泄濁通瘀之功，切中病機，行之有效，是我科用于治脾腎兩虛、瘀濁阻滯所致的DN的良方[13]。

多種信號轉導和轉錄因子都與DN的發生密切相關，如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)、蛋白激酶C、受體酪氨酸激酶信號轉導等[14-15]。Col IV蛋白是一種膠原蛋白，其在腎小球的異常增多會造成腎小球疾病[16]，研究表明中藥黃芪能減少腎臟中Col Ⅳ蛋白的產生[17]，而本實驗處方中黃芪是君藥，對抑制Col IV蛋白產生起到重要作用。FN蛋白含量的增加，提示可能有腎臟纖維化的發生[18]。有研究表明，DN小鼠腎臟Col IV和FN蛋白的表達量明顯升高[19]，Col Ⅳ和FN蛋白是細胞外基質(extracellular matrix，ECM)主要成分蛋白，Col IV、FN合成增加會加劇ECM的集聚，加速DN的進展[20]，腎功能不全以及腎小球形態學的改變是常見的腎臟疾病，糖尿病ECM的集聚則會加重疾病的發生[21]。在本實驗中，益腎泄濁法高、中劑量組能顯著降低大鼠尿液和血液中的血BUN、Scr、HbA1c和24 h尿白蛋白，并且可以降低大鼠腎臟Col IV和FN蛋白的表達；與模型組相比，益腎泄濁法高、中、低劑量組均能使Col IV、FN蛋白和mRNA的表達量減少，可以防治DN病情的發展，為臨床應用提供了一定的實驗支持。但是DN病發病機制錯綜復雜，涉及多種靶點和通路的共同作用，需要在進一步實驗中探索，完善其生物學機制。