HPLC法同時測定麝香抗栓膠囊中馬錢苷、葛根素和芍藥苷成分的含量

季文媛,劉煒*

(1.首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院藥劑科，北京 100038； 2.臨床合理用藥評價北京市重點實驗室，北京 100038； 3.臨床合理用藥評價國際合作聯合實驗室，北京 100038)

麝香抗栓膠囊由人工麝香、羚羊角、忍冬藤、粉葛、大黃、赤芍、川芎、烏梢蛇等二十二味藥材組方，采用粉碎、煎煮、干燥、混合等工藝制備而成的中成藥膠囊劑，具有通絡活血、醒腦散瘀等功效，常用于中風氣虛血瘀癥，臨床癥見半身不遂、言語不清、頭昏目眩等[1-3]。二十二味藥材中粉葛具有解肌退熱、生津止渴、透疹、升陽止瀉、通經活絡、解酒毒等功效[4-7]，忍冬藤具有清熱解毒、疏鳳通絡等功效[8-11]，赤芍具有清熱涼血、散瘀止痛等功效[12-15]。

目前，人口老齡化已是嚴峻的社會問題，隨著老齡化的趨勢不斷升級，老年中風患者增多，麝香抗栓膠囊在臨床上應用也將越來越廣[16-18]。2015年版《中國藥典》[19]收載的麝香抗栓膠囊僅針對赤芍藥材進行含量測定，不能較好地指示該產品的質量水平，且給制假、售假等不法分子可趁之機。為保障用藥安全，本文建立反相高效液相色譜法同時測定麝香抗栓膠囊中馬錢苷、芍藥苷和葛根素成分含量的分析方法，為進一步提高麝香抗栓膠囊的質量控制水平提供技術參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1200型液相色譜儀：配備二極管陣列檢測器，open-lab工作站(美國安捷倫公司)；Phenomonex?luna-C18液相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國菲羅門公司)；Sartorius CPA-225D型十萬分之一電子天平(德國賽多利斯公司)；HT-350A型超聲波清洗機(山東亨通電子設備廠)；Milli-Q?IQ 7000型純水儀(美國密理博公司)。

1.2 試藥與試劑

葛根素對照品(批號：110752-201816，質量分數95.4%)、芍藥苷對照品(批號：110736-201943，質量分數95.1%)、馬錢苷對照品(批號： 111640-201808，質量分數99.0%)均購自中國食品藥品檢定研究院；組方中藥材：購自國藥集團臺州中藥廠，均按照《中國藥典》經劉煒主任藥師鑒定；麝香抗栓膠囊(批號：190615、190912、191204，吉林省七星山藥業有限公司)；甲醇、乙腈(HPLC級，美國Merck試劑公司)；H3PO4(優級純，國藥集團上海化學試劑廠)；實驗用水(超純水，純水機制)；其他試劑(分析純，國藥集團上海化學試劑廠)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomonex?luna-C18液相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測器：二極管陣列檢測器；檢測波長：241 nm；流速：1.2 mL/min；柱溫：27 ℃；進樣體積：20 μL；流動相為乙腈(A)- 0.5% H3PO4溶液，梯度洗脫(0～5 min，5%A；5～19 min，5%～36%A；19～27 min，36%～75%A；27～29 min，75%A；29～30 min，75%～5%A；30～35 min，5%A)。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品儲備液的制備 取馬錢苷、葛根素、芍藥苷對照品適量，精密稱定，置同一100 mL量瓶中，加95%(體積分數，下同)甲醇溶液制備每1 mL含馬錢苷39.60 μg、葛根素76.32 μg、芍藥苷475.50 μg的對照品儲備液，用95%甲醇溶液定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 對照品溶液的制備 取“2.2.1”項下對照品儲備液，精密量取適量，置50 mL量瓶中，加95%甲醇溶液分別制備每1 mL溶液含馬錢苷3.96 μg、葛根素7.63 μg、芍藥苷47.55 μg的對照品溶液，用95%甲醇溶液定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取麝香抗栓膠囊20粒，去除囊殼，將內容物混勻；再取混勻后的粉末約1.0 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加95%甲醇溶液約40 mL，超聲提取20 min(功率300 W，頻率50 kHz)，取出，放冷，用95%甲醇溶液定容至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液即得。

2.2.4 陰性對照溶液制備 按麝香抗栓膠囊藥材配比比例和制備工藝方法制備缺粉葛、赤芍和忍冬藤的陰性對照樣品，按“2.2.3”項下供試品溶液配制方法進行前處理，得陰性對照溶液。

2.3 專屬性試驗

分別取“2.2”項對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，按“2.1”項色譜條件分別進樣20 μL，采集液相色譜圖(見圖1)。可見，葛根素、芍藥苷和馬錢苷與相鄰峰分離度均大于1.5，且在3種成分相應色譜峰位置，陰性對照溶液無干擾峰，3種成分理論塔板數均大于3 000，表明方法專屬性良好。

1.馬錢苷； 2.葛根素； 3.芍藥苷； A.對照品溶液； B.空白溶液； C.陰性對照溶液； D.供試品溶液。

2.4 線性關系的考察

取“2.2.1”項對照品儲備液，分別精密移取1.0、2.0、5.0、10.0、25.0 mL，置50 mL量瓶中，分別制備含馬錢苷、葛根素和芍藥苷的系列標準溶液，按“2.1”項色譜條件分別進樣20 μL，采集液相色譜圖；以3種成分質量濃度(X)為橫坐標，色譜圖中峰面積(Y)為縱坐標進行線性回歸，計算標準曲線方程。結果見表1。

表1 3種成分的標準曲線方程、相關系數及線性范圍Table 1 Standard curve equation, correlation coefficient and linear range of three components

2.5 精密度試驗

取“2.2.2”項下對照品溶液，按“2.1”項色譜條件連續6次進樣20 μL，采集液相色譜圖，計算峰面積相對標準偏差(RSD)。結果馬錢苷、葛根素和芍藥苷峰面積RSD值分別為1.45%、1.12%和1.01%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗

取同一批次麝香抗栓膠囊(批號：190615)樣品6份，分別按“2.2.3”項方法制備供試品溶液；按“2.1”項色譜條件分別進樣20 μL，采集液相色譜圖，計算6份供試品溶液中馬錢苷、葛根素和芍藥苷平均質量分數分別為0.23、0.39、1.42 mg/g，RSD值分別為3.64%、2.89%和3.02%，表明方法重復性良好。

2.7 穩定性試驗

取麝香抗栓膠囊(批號：190615)樣品，按“2.2.3”項方法制備供試品溶液，于室溫下分別放置0、3、6、9、12、24 h后取樣，按“2.1”項色譜條件分別進樣20 μL，采集液相色譜圖，計算得馬錢苷、葛根素和芍藥苷峰面積RSD值分別為1.51%、1.44%和1.29%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.8 加樣回收率試驗

取已測定質量分數的麝香抗栓膠囊(批號：190615)樣品，共取20粒，去除膠囊殼，將內容物混勻，取混勻后的粉末約0.5 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，共稱取6份，分別按表2所示加入馬錢苷、葛根素和芍藥苷對照品適量，按“2.2.3”項方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件分別進樣20 μL，采集液相色譜圖，計算馬錢苷、葛根素和芍藥苷的加樣回收率，結果見表2。可見，3種成分的平均回收率分別為98.2%、99.5%、99.7%，RSD值分別為2.24%、2.51%、2.04%，表明方法準確度良好。

表2 馬錢苷、葛根素和芍藥苷加樣回收試驗結果Table 2 The results of the recovery of puerarin, paeoniflorin and loganin

2.9 樣品中馬錢苷、葛根素和芍藥苷質量分數的測定

取麝香抗栓膠囊，按“2.2.3”項下供試品溶液配制方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件分別進樣20 μL，采集液相色譜圖，計算供試品中馬錢苷、葛根素和芍藥苷的質量分數，結果測得3種成分的平均質量分數分別為0.24、0.39、1.45 mg/g，見表3。

表3 3批麝香抗栓膠囊樣品的質量分數測定結果Table 3 Determination results of three batches of Shexiang kangshuan capsules(n=3) w/(mg·g-1)

3 討論

3.1 檢測波長的確定

本研究采集了190～400 nm波長范圍內的光譜圖，結果顯示馬錢苷、葛根素和芍藥苷分別在238、249、232 nm處有最大吸收，3種待測成分最大吸收波長接近，為使3種成分響應良好，定性、定量準確，最終確定241 nm作為檢測波長，結果證明選擇該波長時，3種成分響應良好，且定性、定量結果準確。

3.2 流動相的確定

本研究比較了不同比例的甲醇-水和乙腈-水作為流動相的效果，發現在流動相中加入適量磷酸有助于改善待測成分的峰型，進一步比較甲醇-0.5%磷酸溶液和乙腈-0.5%磷酸溶液2種流動相體系對馬錢苷、葛根素和芍藥苷分離的影響。結果表明選擇乙腈-0.5%磷酸溶液流動相體系時，3種成分分析時間短、分離效果最佳。

3.3 提取溶劑的確定

麝香抗栓膠囊是由忍冬藤、粉葛、赤芍等二十二味藥材加工制成，藥味較多，基質比較復雜，本研究分別考察提取溶劑為甲醇、95%甲醇溶液、85%甲醇溶液和75%甲醇溶液時對提取效果的影響，結果表明選擇95%甲醇作為提取溶劑時，提取效果最佳且基質無干擾，因此選擇95%甲醇作為提取溶劑。

本文建立了同時測定麝香抗栓膠囊中馬錢苷、葛根素、芍藥苷成分質量分數的高效液相色譜法，方法簡便、準確、重復性好，可為全面保證該產品的質量提供技術參考。