芥子及其炮制品配方顆粒的UPLC指紋圖譜研究

何民友，王利偉，吳淑珍，李國衛，吳文平，孫冬梅

(廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室,廣東 佛山 528244)

芥子為十字花科植物白芥SinapisalbaL. 或芥Brassicajuncea(L.)Czern. et Coss. 的干燥成熟種子。前者習稱“白芥子”，后者習稱“黃芥子”[1]。首載于《名醫別錄》，列為上品，其性味辛溫，歸肺經，具有溫肺豁痰利氣、散結通絡止痛之功效，用于寒痰咳嗽，胸脅脹痛，痰滯經絡，關節麻木、疼痛，痰濕流注，陰疽腫毒。現代研究證明白芥子含有白芥子苷、脂肪油、芥子堿、芥子酶等成分，可助機體對不正常滲出物的吸收，故臨床中取其辛散走竄之力，散結消腫之功，可廣泛應用于痰瘀阻絡所致的內科、外科及婦科多種疾病[2]。黃芥子含芥子苷、芥子酶、芥子酸、芥子堿、脂肪油等，有平喘和抑制皮膚真菌的作用[3]，白芥子去痰平喘的功效要比黃芥子好；所以如果要用黃芥子代替白芥子時需加量使用[4]。生芥子辛散力強，善于通絡止痛，但芥子油有刺鼻的辛辣味及刺激作用，能使皮膚和黏膜發生水腫、水泡，大劑量則引起強烈的胃腸道刺激。芥子炒后可緩和辛散走竄之性，避免耗氣傷陰，并善于順氣豁痰，多用于痰多咳嗽。因此臨床上多以其炒制品配伍入方劑，以“殺酶保苷”，發揮藥效，同時炒后種皮破裂，有效成分易煎出，充分發揮其利氣散結等功效[5-6]。

目前關于芥子配方顆粒的化學成分和藥理研究的文獻較少，尚未見對不同基原或炮制品芥子配方顆粒區別研究的報道。研究發現，以水為溶劑提取時，白芥子生、炒品的HPLC指紋圖譜有顯著差異，部分主峰發生了較大變化；白芥子和黃芥子的HPLC色譜圖也有明顯的差異[7-11]。本文以15批不同產地的白芥子和黃芥子飲片及其相應炮制品分別制備標準湯劑，并用其中3批飲片制備配方顆粒，通過UPLC法測定標準湯劑和配方顆粒指紋圖譜，建立基于標準湯劑的芥子配方顆粒指紋圖譜鑒別方法，為芥子配方顆粒的質量評價提供科學依據，并為進一步詮釋芥子不同基原及其炮制品的科學內涵奠定基礎。

1 儀器、材料與試藥

Waters高效液相色譜儀(Waters H-Class，Waters公司)，Thermo高效液相色譜儀(Thermo Vanquish，賽默飛世爾科技有限公司)，Waters CORTECS T3色譜柱(2.1 mm×150 mm，1.6μm)，ME204E萬分之一天平(梅特勒-托利多公司)，KQ500DE數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，Milli-Q Direct超純水系統(默克股份有限公司)，HWS28電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司)。

芥子堿硫氰酸鹽(批號111702-201605，中國食品藥品檢定研究院，質量分數98.3%)，芥子酸(批號wkq18030911，四川省維克奇生物科技有限公司，質量分數≥98%)。15批白芥子藥材、15批黃芥子藥材采集于國內各產地，15批炒白芥子、15批炒黃芥子均由廣東一方制藥有限公司標準化部炮制，經廣東一方制藥有限公司質量部檢測均符合2015年版《中國藥典》“芥子”項下要求；15批白芥子標準湯劑、15批炒白芥子標準湯劑、15批黃芥子標準湯劑、15批炒黃芥子標準湯劑、3批白芥子配方顆粒、3批炒白芥子配方顆粒、3批黃芥子配方顆粒和3批炒黃芥子配方顆粒均來自廣東一方制藥有限公司，具體來源及批號見表1～2。

表1 (續)

表1 白芥子、炒白芥子及其制劑信息表 Table 1 The information of Sinapis alba and its processed products

乙醇、甲醇為分析純；液相用磷酸、乙腈、甲醇為HPLC色譜級，水為純凈水。

表2 黃芥子、炒黃芥子及其制劑信息表Table 1 The information of Brassica juncea and its processed products

2 方法與結果

2.1 芥子標準湯劑凍干粉和配方顆粒的制備

2.1.1 標準湯劑凍干粉 按照《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求(征求意見稿)》[12]和國家中醫藥管理局《醫療機構中藥煎藥室管理規范》[13]，稱取白芥子飲片，煎煮2次。第1次加水8倍量，浸泡30 min，煎煮30 min，濾過；第2次加水6倍量，煎煮25 min，濾過，合并濾液，減壓濃縮至飲片投料量，冷凍干燥，即得白芥子標準湯劑凍干粉，同法制備其他標準湯劑凍干粉。

2.1.2 標準湯劑配方顆粒 取白芥子飲片4 000 g，第1次加水8倍量，浸泡30 min，煎煮30 min，濾過；第2次加水6倍量，煎煮，濾過，合并濾液后濃縮成清膏(干浸膏出膏率約22%)，加入輔料適量，干燥、粉碎，再加入輔料適量，混勻，制粒，制成1 000 g白芥子配方顆粒，同法制備黃芥子配方顆粒。

2.2 色譜條件

色譜柱：Waters CORTECS T3(2.1 mm×150 mm，1.6 μm)；以甲醇為流動相A，以0.1%(體積分數，下同)H3PO4溶液為流動相B進行梯度洗脫，洗脫程序位0～13 min，0%A→3%A；13～14 min，3%A→15%A；14～23 min，15%A→15%A；23～34 min，15%A→24%A，34～44 min，24%A→45%A；44～50 min，45%A→85%A。流速為0.25 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣體積為2 μL，檢測波長為278 nm。

2.3 對照品、供試品溶液的制備

2.3.1 芥子堿硫氰酸鹽對照品溶液 取芥子堿硫氰酸鹽對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含芥子堿硫氰酸鹽100 μg的對照品溶液，即得。

2.3.2 芥子酸對照品溶液 取芥子酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含芥子酸20 μg的對照品溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液 分別取白芥子標準湯劑、黃芥子標準湯劑、白芥子配方顆粒、黃芥子配方顆粒、炒白芥子標準湯劑、炒黃芥子標準湯劑、炒白芥子配方顆粒和炒黃芥子配方顆粒約0.1 g，精密稱定，具100 mL塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定質量，超聲處理(功率300 W，頻率 50 kHz)30 min，取出，放冷，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，0.22 μm濾膜濾過，即得。

2.4 參照峰的選擇

按“2.2”項下色譜條件進行梯度洗脫，芥子堿硫氰酸鹽色譜峰保留時間適中，峰面積穩定，峰型較好，且峰面積大于10%，故選擇芥子堿為參照峰進行各飲片、標準湯劑及配方顆粒相對保留時間的計算。

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度考察 分別取白芥子標準湯劑、黃芥子標準湯劑、白芥子配方顆粒、黃芥子配方顆粒、炒白芥子標準湯劑、炒黃芥子標準湯劑、炒白芥子配方顆粒和炒黃芥子配方顆粒粉末各0.1 g，精密稱定，按“2.3.3”項下方法分別制成供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件重復進樣6次進行測定，計算各特征峰的相對保留時間，其RSD值均<3.0%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 穩定性考察 分別取白芥子標準湯劑、黃芥子標準湯劑、白芥子配方顆粒、黃芥子配方顆粒、炒白芥子標準湯劑、炒黃芥子標準湯劑、炒白芥子配方顆粒和炒黃芥子配方顆粒粉末各0.1 g，精密稱定，按“2.3.3”項下方法分別制成供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，計算各特征峰相對保留時間，其RSD值均<3.0%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.5.3 重復性考察 分別取白芥子標準湯劑、黃芥子標準湯劑、白芥子配方顆粒、黃芥子配方顆粒、炒白芥子標準湯劑、炒黃芥子標準湯劑、炒白芥子配方顆粒和炒黃芥子配方顆粒粉末各6份，每份0.1 g，精密稱定，按“2.3.3”項下方法分別制成供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，計算各特征峰相對保留時間，其RSD值均<3.0%，表明方法重復性良好。

2.6 白芥子、黃芥子配方顆粒UPLC指紋圖譜的區別分析

分別取15批白芥子和15批黃芥子飲片，按“2.1.1”項下方法制備標準湯劑，其中3批白芥飲片(BJ13、BJ14、BJ15)制備白芥子配方顆粒，3批黃芥子飲片(HJ08、HJ09、HJ10)制備黃芥子配方顆粒，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，以“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件(2012版)”(以下簡稱“相似度評價軟件”)對15批白芥子標準湯劑和15批黃芥子標準湯劑進行匹配分析，時間窗口寬度設為0.1 min，多點校正，全譜峰匹配，按照中位數法建立各標準湯劑的對照指紋圖譜共有峰模式，白芥子標準湯劑標定共有峰13個，黃芥子標準湯劑標定共有峰6個，見圖1～2。設定色譜峰自動匹配，按照中位數法生成對照指紋圖譜，并進行整體相似度評價，結果各標準湯劑的15批次樣品與對照指紋圖譜相比，相似度均大于0.99。說明所建立的對照指紋圖譜具有較好的代表性，可用于標準湯劑的指紋圖譜比較研究。對3批白芥子配方顆粒和3批黃芥子配方顆粒進行匹配分析，所得共有峰與標準湯劑相一致。見圖3～4。

5(S).芥子堿； 13.芥子酸； S1～S15.分別為批號BJT01～BJT15的白芥子標準湯劑。

1(S).芥子堿； 6.芥子酸； S1～S15.分別為批號BJT01～BJT15的黃芥子標準湯劑。

5(S).芥子堿； 13.芥子酸； S1～S3.分別為批號BJK01～BJK03的白芥子配方顆粒。

1(S).芥子堿； 6.芥子酸； S1～S3.分別為批號HJK01～HJK03的黃芥子配方顆粒。

由圖1～2可知，15批白芥子標準湯劑指紋圖譜共檢出13個色譜峰，各色譜峰分離效果好，且響應值較高，不同產地之間差異不明顯； 15批黃芥子標準湯劑指紋圖譜共檢出6個色譜峰，與白芥子標準湯劑相比區別明顯； 3批白芥子配方顆粒和3批黃芥子配方顆粒各共有特征峰與標準湯劑指紋圖譜基本一致，具有很好的重現性，表明基于標準湯劑建立的指紋圖譜可用于配方顆粒的質量評價。由圖3～4可看出，白芥子配方顆粒和黃芥子配方顆粒的區別明顯，兩者具有共有成分芥子堿和芥子酸，黃芥子配方顆粒在芥子堿峰前沒有檢測到色譜峰，而白芥子配方顆粒則出現4個特征峰。

2.7 白芥子、炒白芥子配方顆粒UPLC指紋圖譜的區別分析

分別取15批白芥子和15批炒芥子飲片，按“2.1.1”項下方法制備標準湯劑，其中3批白芥飲片(BJ13、BJ14、BJ15)制備白芥子配方顆粒，3批炒白芥子飲片(BJ113、BJ114、BJ115)制備炒白芥子配方顆粒，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，以相似度評價軟件對15批白芥子標準湯劑和15批炒白芥子標準湯劑進行匹配分析，時間窗口寬度設為0.1min，多點校正，全譜峰匹配，按照中位數法建立各標準湯劑的對照指紋圖譜共有峰模式，白芥子標準湯劑標定共有峰13個，炒白芥子標準湯劑標定共有峰11個； 見圖1、5。進行整體相似度評價，相似度均大于0.99。對3批白芥子配方顆粒和3批炒白芥子配方顆粒進行匹配分析，所得共有峰與標準湯劑相一致。見圖3、6。

由圖5～6可知，15批炒白芥子標準湯劑共檢出11個色譜峰，炒白芥子配方顆粒檢出色譜峰與標準湯劑一致； 對比圖3與圖6可發現，白芥子炒制后配方顆粒1號峰(相對保留時間為0.51)、12號峰(對保留時間為1.55)及13號峰(對保留時間為1.57)消失，3號峰(對保留時間為0.81)峰面積明顯增加。

4(S).芥子堿； S1～S15.分別為批號BJT101～BJT115的炒白芥子標準湯劑。

2.8 黃芥子、炒黃芥子UPLC指紋圖譜的區別分析

分別取15批黃芥子和15批炒黃芥子飲片，分別按“2.1.1”項下方法制備標準湯劑，其中3批制備黃芥子飲片(HJ08、HJ09、HJ10)制備黃芥子配方顆粒和3批炒黃芥子飲片(HJ108、HJ109、HJ110)制備炒黃芥子配方顆粒，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，以相似度評價軟件對15批黃芥子標準湯劑和15批炒黃芥子標準湯劑進行匹配分析，時間窗口寬度設為0.1min，多點校正，全譜峰匹配，按照中位數法建立各標準湯劑的對照指紋圖譜共有峰模式，黃芥子標準湯劑標定共有峰11個，炒黃芥子標準湯劑標定共有峰8個； 見圖2、7。進行整體相似度評價，相似度均大于0.99。對3批黃芥子配方顆粒和3批炒黃芥子配方顆粒進行匹配分析，所得共有峰與標準湯劑相一致。見圖4、8。

3(S).芥子堿； 8.芥子酸； S1～S15.分別為批號HJT101～HJT115的炒黃芥子標準湯劑。

3(S).芥子堿； 8.芥子酸； S1～S3.分別為批號HJK101～HJK103的黃芥子配方顆粒。

由圖7～8可知，15批炒黃芥子標準湯劑共檢出8個色譜峰，炒黃芥子配方顆粒檢出色譜峰與標準湯劑一致； 對比圖4、8可發現，二者的差異主要體現在保留時間0～25 min，經炒制后在相對保留時間為0.25和0.41處新增2個峰(峰1、2)，25 min之后各色譜峰差別主要在于炒制后峰面積的變化。

3 討論

通過系統比較研究，建立了白芥子配方顆粒和黃芥子配方顆粒及其炮制品配方顆粒的UPLC指紋圖譜測定方法。對檢測波長、色譜條件、供試品制備方法等進行了考察，經紫外-可見全波長(190～400 nm)掃描，發現在230、254、278 nm 3個波長下吸收最佳，在278 nm處各色譜峰較響應值較均勻，各色譜峰信號較強，基線平穩、干擾較小，因此選擇278 nm作為檢測波長。同時對甲醇-0.1%H3PO4、甲醇-0.1%乙酸、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.1% H3PO4、乙腈-水及酸水溶液等不同組成的流動相進行了考察，結果以甲醇-0.1% H3PO4梯度洗脫樣品分離較佳。對CORTECS T3(1.6 μm，2.1 mm×150 mm)、Agilent SB C18(1.7 μm，2.1 mm×150 mm)、Waters BEH C18(1.8 μm，2.1 mm×150 mm)、Waters HSS T3 C18(1.8 μm，2.1 mm×150 mm)4種品牌色譜柱的色譜圖進行比較，發現不同品牌色譜柱對各特征峰分離影響較大，使用CORTECS T3(1.6 μm，2.1 mm×150 mm)色譜柱各特征峰分離效果較好。在供試品溶液前處理中對比不同提取溶劑、提取方式及提取時間的效果，發現使用50%甲醇50 mL超聲處理30 min為最佳。結果表明此法穩定、可靠、重復性好，可用于芥子及其炮制品配方顆粒指紋圖譜的分析測定。

本研究選用15批飲片制備標準湯劑，其中3批制備配方顆粒，通過15批標準湯劑建立對照指紋圖譜，結果發現3批配方顆粒與標準湯劑對照指紋圖譜基本一致。通過分析4種配方顆粒UPLC圖譜，發現白芥子、炒白芥子、黃芥子和炒黃芥子配方顆粒的UPLC圖譜差異明顯。白芥子和黃芥子中均以芥子堿硫氰酸鹽(S峰)為主要成分，炒制后該成分的峰面積略有降低。白芥子配方顆粒指紋圖譜共檢出13個色譜峰，而黃芥子配方顆粒指紋圖譜共檢出6個色譜峰，色譜峰明顯減少，在0～30 min內，白芥子配方顆粒指紋圖譜共檢出6個色譜峰，而黃芥子配方顆粒僅檢出與芥子堿硫氰酸鹽對照品相對應的色譜峰，因此可通過0～30 min來鑒別區分白芥子配方顆粒和黃芥子配方顆粒。白芥子配方顆粒與炒白芥子配方顆粒主要區別點為炒制后1號峰(相對保留時間為0.51)、12號峰(相對保留時間為1.55)及13號峰(相對保留時間為1.57)消失。黃芥子配方顆粒與炒黃芥子配方顆粒主要區別點為經炒制后在0～25 min新增2個峰(峰1、2)。

楊雪萍等[14]通過研究發現白芥子炒制后產生大量的對羥基苯乙腈，而且炒制時間越長生產的量越多； 馮寶民等[15]從炒白芥子中分離得到新化合物，并命名為白芥子醛； 芥子堿類和硫代葡萄糖苷類是芥子中主要化學成分，硫代葡萄糖苷類和芥子堿類成分熱不穩定[4]，因而炮制后該類化合物發生變化。

在以往研究的基礎上[10-11]，本研究建立的UPLC指紋圖譜方法分離效果良好，通過指紋圖譜可發現白芥子配方顆粒和黃芥子配方顆粒區別明顯； 生品和炮制品之間區別明顯，白芥子經炮制后1號峰消失，黃芥子經炮制后新增1、2號峰。為已失去飲片特性的芥子及其炮制品配方顆粒的質量控制提供科學依據。