基于UPLC/Q-TOF MS法分析生何首烏藥材的化學成分

靳寶芬，葉昊，王鳳云，鐘艷梅

(1.深圳市寶安區福永人民醫院，廣東 深圳 518103； 2.廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006； 3.廣東藥科大學新藥研發中心，廣東 廣州 510006)

何首烏為蓼科何首烏屬多年生草本植物何首烏(PolygonummultiflorumThunb.)的干燥塊根，其味苦、甘、澀，性微溫，歸肝、心、腎經[1]，主產于廣東、廣西、河南、湖北、貴州、四川等地[2]。何首烏作為常用的補益類中藥，最早記載于《何首烏傳》，之后在《開寶本草》等歷代本草中均有記載[3]。現代藥理研究表明，何首烏中的主要化學成分有黃酮類化合物、蒽醌衍生物、磷脂與苯丙素類化合物等，其特征性成分為二苯乙烯苷類，具有抗感染[4]、抗疲勞[5]、抗衰老[6]、增強免疫力[7]、神經保護[8]、肝臟保護[9]、降血脂[10]、抗動脈粥樣硬化[11]等作用。

目前，對何首烏的物質基礎及化學成分的研究尚不夠全面，阻礙了對其藥理作用的深入研究，難以實現對藥材質量的綜合評價。近年來，液相色譜—質譜聯用技術被廣泛應用于難揮發性、極性、熱不穩定、大分子化合物的分析[12-14]。超高效液相色譜—串聯四極桿飛行時間質譜(UPLC/Q-TOF MS)具有分辨率高、靈敏度高、選擇性高、用時短、掃描范圍廣等特點，能夠快速得出精確的分子質量信息和二級特征裂解碎片離子信息[15-18]。本研究擬采用UPLC/Q-TOF MS技術對生何首烏藥材進行全成分掃描與快速鑒定，為生何首烏藥材的成分分析提供方法參考，為其進一步開發與利用奠定理論基礎。

1 儀器及材料

1.1 儀器與裝置

ACQUITY超高效液相色譜分析系統，Q-TOF micro高分辨四極桿與飛行時間串聯質譜儀(配有lock-spray接口，美國Waters公司)；Masslynx4.1數據軟件處理系統(美國Waters公司)；ACUQITY UPLCTM BEM C18反相色譜柱(2.1 mm×50 mm×1.7 μm，美國Waters公司)；DL-360A超聲波清洗器(50 Hz，400 W，上海之信儀器有限公司)；超低有機物型 Arium611 UV超純水器(德國Sartorius公司)。

1.2 材料與試劑

生何首烏藥材購自廣州至信藥業股份有限公司，經廣東藥科大學中藥學院王鳳云老師鑒定為何首烏(PolygonummultiflorumThunb.)的干燥塊根，藥材標本保存于廣東藥科大學中心實驗室；大黃素對照品(質量分數≥98%，批號：110756-201512，中國食品藥品檢定研究院)；2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯葡萄糖苷對照品(質量分數≥98%，批號：82373-94-2，上海士鋒生物科技有限公司)；乙腈(UPLC級，德國Merck公司)；甲醇(HPLC級，德國Merck公司)；甲酸(色譜純，美國DIMA公司)；亮氨酸-腦啡肽(質量分數≥95%，批號：L9133-50MG，美國Sigma公司)。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLCTMBEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm×1.7 μm)；流速：0.4 mL/min；進樣量：5 μL；柱溫：30 ℃；0.1%甲酸水為流動相A，乙腈為流動相B，梯度洗脫(0～3 min，98%～85%A；3～10 min，85%～78%A；10～15 min，78%～50%A；15～20 min，50%～30%A；20～22 min，30%～10%A；22～25 min，10%～0%A；25～30 min，0%～98%A)。

2.2 質譜條件

毛細管電壓：3 000 V；錐孔電壓：30 V；離子源溫度：120 ℃；脫溶劑溫度：350 ℃；碰撞能量：10 V；錐孔反吹氮氣流速：50 L/h；脫溶劑氮氣流速：500 L/h；脫溶劑氣體為氮氣；碰撞氣體為氬氣；負離子模式采集數據，采用Lock Mass通路對實驗數據進行實時校正，Lock Mass為腦啡肽(10 mg/L)，負離子模式下高分辨分子離子峰[M-H]-554.261 5，校正切換頻率為10次/s，掃描范圍為m/z50～1 400。

2.3 供試品溶液的制備

取生何首烏藥材5 g，加入90%(體積分數，下同)甲醇水溶液25 mL超聲2 h，將何首烏提取液1 mL加于2 mL離心管中，離心5 min(25 ℃，12 000 r/min)，取上清液，即得。

2.4 精密度試驗

精密吸取同一供試品溶液，連續進樣6次，每次進樣5 μL，結果各主要色譜峰的保留時間的RSD值均<0.3%，相對峰面積的RSD值均<3%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩定性試驗

取同一供試品溶液，分別于0、1、2、4、12、24 h每次進樣5 μL進行檢測，結果各主要色譜峰的保留時間的RSD值均<0.3%，相對峰面積的RSD值均<3%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.6 重復性試驗

按規定的色譜條件及質譜條件，分別再次制備供試品6份進樣檢測，每次進樣5 μL，結果對比各主要峰的保留時間的RSD值均<0.3%，相對峰面積的RSD值均<3%，表明方法重復性良好。

3 結果與分析

生何首烏藥材供試品在ESI負離子模式下獲得了良好的響應值，在30 min內供試品中的化學成分得到有效分離。采用Masslynx4.1軟件分析供試品中各化學成分的保留時間及其質譜信息，并結合分子離子峰及文獻報道的數據進行對比，再通過與Scifinder、Chemspider等數據庫進行峰匹配檢索，對其中的化學成分進行分析辨別，最終識別并鑒定了22個色譜峰信號，生何首烏藥材供試品在負離子模式下的總離子流圖見圖1。

圖1 生何首烏藥材供試品在負離子模式下的總離子流圖Figure 1 Total ion current diagram of raw Polygoni Multiflori Radix in negative ion mode

下面以峰6和峰20為例說明分析鑒定過程：

通過軟件分析得到峰6的質譜數據，其分子離子峰[M-H]-為m/z405.116 1，預測其分子式為C20H22O9，其二級質譜圖及裂解行為見圖2，主要特征碎片有m/z243.064 4，是由分子離子峰失去一分子—glu(-162)產生的特征碎片，與文獻[19-20]報道的2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯葡萄糖苷的質譜數據相一致；2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯葡萄糖苷對照品在負離子模式下的總離子流圖見圖3，峰6與對照品中峰1的保留時間和質譜數據相一致；因此，推斷峰6所對應化學成分即為2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯葡萄糖苷。

圖2 峰6的ESI MS/MS圖譜及裂解行為Figure 2 ESI MS/MS map and cracking behavior of peak 6

圖3 2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯葡萄糖苷對照品在負離子模式下的總離子流圖Figure 3 Total ion current diagram of reference substance of Stibene glucoside in negative ion mode

同理，通過軟件分析得到峰20的質譜數據，其分子離子峰[M-H]-為m/z269.043 5，預測其分子式為C15H1OO5，其二級質譜圖及質譜裂解行為見圖4，主要特征碎片有m/z225.039 7，是由分子離子峰失去一分子—CO2(-44)產生的特征碎片，m/z241.039 3是由分子離子峰失去一分子—CO(-28)產生的特征碎片，與文獻[21]報道的大黃素的質譜數據相一致；大黃素對照品在負離子模式下的總離子流圖見圖5，峰20與對照品中峰1的保留時間和質譜數據相一致；因此，推斷峰20所對應化學成分即為大黃素。

圖4 峰20的ESI MS/MS圖譜及裂解行為Figure 4 ESI MS/MS map and cracking behavior of peak 20

圖5 大黃素對照品在負離子模式下的總離子流圖Figure 5 Total ion current diagram of reference substance of Emodin in negative ion mode

同理，通過Masslynx4.1軟件分析將保留時間、質譜數據及裂解碎片離子信息等與各數據庫、文獻報道比對，分析及鑒定剩余的20個色譜峰信號所對應的化學成分，各色譜峰信號所對應化學成分的分析及鑒定結果見表1，包括蒽醌類化合物7個，二苯乙烯苷類化合物5個，黃酮類化合物3個，有機酸2個，其他類化合物5個。

表1 生何首烏藥材供試品各色譜峰信號所對應化學成分的檢測及分析結果Table 1 Detection and analysis results of chemical components corresponding to each chromatographic peak signal of raw Polygoni Multiflori Radix

其中，峰18和峰22所對應的化學成分在生何首烏藥材中為首次報道，通過軟件分析得到峰18的質譜數據，其分子離子峰[M-H]-為m/z757.179 3，預測其分子式為C39H34O16，其二級質譜圖及裂解行為見圖6，主要特征碎片有m/z559.109 3，是由分子離子峰丟失一分子—C9H10O5(-198)產生的特征碎片，m/z541.205 8是由特征碎片m/z559.109 3丟失一分子—H2O(-18)產生的特征碎片。同理得到峰22的質譜數據，其分子離子峰[M-H]-為m/z523.137 9，預測其分子式為C31H24O8，其二級質譜圖及質譜裂解行為見圖7，主要特征碎片有m/z508.245 1，是由分子離子峰丟失一分子—CH3(-15)產生的特征碎片，m/z480.299 0是由特征碎片m/z508.245 1丟失一分子—CO(-28)產生的特征碎片。

圖6 峰18的ESI MS/MS圖譜及裂解行為Figure 6 ESI MS/MS map and cracking behavior of peak 18

圖7 峰22的ESI MS/MS圖譜及裂解行為Figure 7 ESI MS/MS map and cracking behavior of peak 22

根據與數據庫中的信息比對，峰18和峰22可能的化學結構分別見圖8和圖9，均為二聚體化學成分。

圖8 峰18可能的化學結構Figure 8 Possible chemical structure to peak 18

圖9 峰22可能的化學結構Figure 9 Possible chemical structure to peak 22

4 討論

本研究建立了快速分析生首烏藥材化學成分的UPLC/Q-TOF-MS方法，研究結果表明生何首烏藥材樣本在負離子模式下響應良好，色譜峰得到良好分離。采用Masslynx 4.1對實驗數據進行分析，根據各個化合物的高分辨分子量，與數據庫、文獻報道及對照品譜圖比對鑒定，分析鑒定了生何首烏藥材樣本的化學成分，獲得了較好的結果，共分析及鑒定了生何首烏藥材中的22種化學成分，包括蒽醌類化合物7個，二苯乙烯苷類化合物5個，黃酮類化合物3個，有機酸2個，其他類化合物5個，其中2種二聚體化學成分(峰18，tR=12.771 min，m/z=757.179 3；峰22，tR=20.997 min，m/z=523.137 9)為首次從生何首烏藥材中發現

據文獻報道，峰18對應的化學成分曾從蓼科蕎麥中被分離出來并被認為具有抗氧化、抗癌、抗感染等功效[23]，此次首次從同為蓼科的生何首烏藥材中發現該化學成分，推測生何首烏的抗氧化、抗癌、抗感染等作用可能與該化學成分有關。

通過查閱文獻，峰22對應的化學成分曾在蓼科虎杖中被分離出來并被鑒定為有效的PTP1B抑制劑，具有顯著的降糖作用，能用于治療2型糖尿病[24]，此次首次從同為蓼科的生何首烏藥材中發現該化學成分，推測生何首烏的降糖作用可能與該化學成分有關，表明生何首烏可能是一種潛在的治療2型糖尿病的藥物。

本研究結果為系統研究生何首烏藥材的化學成分及闡述其藥效物質基礎提供了依據，為進一步解釋生何首烏藥理藥效作用機制提供了理論支撐。