濕熱因素對蒲公英配方顆粒中咖啡酸穩定性的影響

鄧淙友，李定發，蔡林泰，張堅祥，李秀枝，李映娜，吳輝強，王閩予

(廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室，廣東 佛山 528244)

蒲公英(TaraxacummongolicumHand. -Mazz.)為多年生菊科蒲公英屬草本植物，是一種應用廣泛的藥食同源植物。蒲公英全草入藥，現代研究表明蒲公英的化學成分主要是多糖類、萜類、有機酸類、總黃酮類等，具有抗癌、抗腫瘤、抗氧化性、清除自由基和抑菌等多種藥理作用，臨床上主要用于治療胃潰瘍、胃炎等疾病[1-4]。

蒲公英配方顆粒由蒲公英藥材經炮制成飲片后，采用提取、濃縮和制劑工藝精制而成，有效成分為水溶性成分咖啡酸。李雙等[5]研究表明咖啡酸在水溶液中不穩定，且在高溫和光照條件下易被氧化降解。由于中藥配方顆粒仍處于國家試點階段，各生產企業的生產工藝不盡一致，而且2015年版《中國藥典》對蒲公英的炮制工藝也未作詳細規定。蒲公英配方顆粒生產過程中經常出現咖啡酸質量分數差異較大的現象，這是由于生產企業炮制工藝差異、生產過程控制，還是其他原因引起，目前還不明確。本研究旨在探討咖啡酸在蒲公英配方顆粒生產過程中水環境下的主要影響因素及變化規律，為蒲公英配方顆粒生產質量控制提供依據。

1 儀器與試藥

Waters e2695高效液相色譜儀(沃特世公司)；KQ-500DE型超聲清洗器(昆山儀器公司)；FE20型PH計(梅特勒-托利多公司)；ME204E萬分之一天平(梅特勒-托利多公司)；HWS-28型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學儀器有限公司)；DHG-9146A電熱恒溫鼓風干燥箱(精宏儀器公司)。

咖啡酸(批號：110885-201703，質量分數為99.70%，中國食品藥品檢定研究院)；甲醇(色譜純，水為自制超純水)；甲酸、NaH2PO4等試劑均為分析純。藥材樣品經廣東一方制藥有限公司質量中心鑒定為菊科植物蒲公英TaraxacummongolicumHand.-Mazz.的干燥全草。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-磷酸鹽緩沖液(取NaH2PO31.56 g，加水使溶解成1 000 mL，再加1%磷酸溶液調節pH值至3.8～4.0)(體積比23∶77)；流速：1 mL/min；檢測波長：323 nm；柱溫：40 ℃，進樣量：5 μL。理論板數按咖啡酸峰計算應不低于3 000。

2.2 對照品溶液的制備

稱取咖啡酸對照品5.13 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得咖啡酸對照品儲備液(102.29 μg/mL)。精密吸取上述對照品儲備液3 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成咖啡酸質量濃度為30.70 μg/mL的對照品溶液。咖啡酸對照品圖譜見圖1。

圖1 咖啡酸對照品高效液相色譜圖Figure 1 HPLC of caffeic acid reference substance

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 藥材樣品供試品溶液的制備[6]取蒲公英藥材粗粉約1 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入5%(質量分數，下同)甲酸的甲醇溶液10 mL，密塞，搖勻，稱定質量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，取出，放冷，再稱定質量，用5%甲酸的甲醇溶液補足減失的重量，搖勻，離心，取上清液，置棕色量瓶中，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3.2 清膏樣品供試品溶液的制備[7]取蒲公英清膏約1 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加入5%甲酸的50%甲醇溶液約45 mL，密塞，超聲處理(功率300 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，加5%甲酸的50%甲醇溶液補至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，置棕色量瓶中，即得。

2.4 線性關系考察

精密吸取咖啡酸對照品儲備液(102.29 μg/mL)1、2、4、6、8 mL，分別置于10 mL量瓶中，再分別加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成不同濃度的系列對照品溶液。精密吸取上述系列對照品溶液，按“2.1”項色譜條件測定，以峰面積積分值為縱坐標，進樣量(ng)為橫坐標，得到咖啡酸標準曲線為y= 6 307.78x- 738.57，表明咖啡酸在51.1～409.3 ng與峰面積呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗

吸取咖啡酸對照品溶液，按“2.1”項色譜條件連續進樣6次測定咖啡酸峰面積，計算得其RSD值為0.56%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗

取同一批蒲公英藥材(批號FY1902006)樣品各6份，按“2.3.1”項方法制備供試品溶液，分別進樣測定咖啡酸峰面積，計算得其RSD為1.52%，表明方法重復性良好。

2.7 穩定性試驗

取蒲公英藥材(批號FY1902006)供試品溶液，分別于0、3、6、8、10、12 h進行測定，結果測得咖啡酸峰面積的RSD值為1.45%，表明樣品在12 h內穩定。

2.8 加樣回收率試驗

取已知質量分數的樣品(批號:FY1902006，咖啡酸：0.855 mg/g)適量，取約0.5 g，平行6份，精密稱定，分別加入咖啡酸對照品0.414 mg，制備供試品溶液。結果得咖啡酸回收率在93%～105%之間，RSD為1.03%，表明方法準確度良好。

2.9 樣品質量分數的測定

2.9.1 蒲公英藥材水洗供試品的制備與質量分數的測定 取蒲公英藥材(批號FY1902006)300 g，平均分成3份，其中2份樣品模擬藥材前處理生產工序(加入藥材質量20倍水，藥材在水中快速漂洗，每次洗滌時間為2 min)進行試驗，分別進行水洗1次(編號：水洗1)，水洗2次(編號：水洗2)后，瀝干水分，置電熱恒溫鼓風干燥箱中60 ℃烘干6 h；另1份蒲公英藥材不進行水洗處理(編號：水洗0)，按同樣烘干方法進行平行試驗。3份樣品烘干處理后分別粉碎，備用。按“2.3.1”項方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件測定，結果測得蒲公英藥材水洗0次、1次、2次的咖啡酸質量分數分別為0.746、0.347、0.267 mg/g，色譜圖見圖2。

圖2 水洗工序下蒲公英藥材咖啡酸質量分數變化色譜圖Figure 2 Chromatograms of content of coffee acid in Taraxacum under washing process

可見，蒲公英藥材經水洗1次后，咖啡酸質量分數降低了約50%，經水洗2次后則降低了約65%，表明生產前處理水洗工序對蒲公英藥材咖啡酸質量分數下降有較大的影響。

2.9.2 蒲公英藥材水潤供試品的制備與質量分數的測定 取蒲公英藥材(批號FY1902006)400 g，平均分成4份，其中3份加入藥材質量1倍水，在室溫中分別放置3 h(編號：水潤1)、6 h(編號：水潤2)、9 h(編號：水潤3)后，按相同的時間與溫度(6 h，60 ℃)進行烘干；另一份蒲公英藥材不水潤處理(編號：水潤0)，按同樣烘干方法進行平行試驗。4份樣品烘干處理后分別粉碎，備用。按“2.3.1”項方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件測定。結果測得編號水潤0、水潤1、水潤2、水潤3樣品中咖啡酸的質量分數分別為0.855、0.474、0.189、0.022 mg/g，色譜圖見圖3。

圖3 水潤條件下蒲公英藥材咖啡酸質量分數變化色譜圖Figure 3 Chromatograms of content of caffeic acid in Taraxacum under water and wet conditions

可見，蒲公英藥材在水潤條件下放置3 h，咖啡酸質量分數降低了約50%，放置6 h后降低了約80%，放置9 h后降低約97%，表明水潤條件下，蒲公英藥材咖啡酸質量分數隨著放置時間推移呈明顯下降趨勢。

2.9.3 蒲公英提取濃縮液清膏樣品的制備與質量分數的測定 取蒲公英藥材(批號FY1902006)100 g，按蒲公英配方顆粒生產工藝進行提取濃縮，得蒲公英提取濃縮液清膏，取約100 mL，置具塞錐形瓶中，精密稱定。清膏分別在65 ℃水浴條件下放置0、2、4、6、8 h(分別編號清膏0、清膏1、清膏2、清膏3、清膏4)后補重，分別取樣，備用。按“2.3.2”項方法制備供試品溶液，“2.1”項色譜條件測定。結果測得編號清膏0、清膏1、清膏2、清膏3、清膏4的樣品中咖啡酸的質量分數分別為0.192、0.195、0.196、0.195、0.203 mg/g，色譜圖見圖4。可見，清膏在水浴65 ℃條件下、放置8 h，蒲公英提取濃縮液清膏咖啡酸的質量分數較穩定，無明顯變化。

圖4 65 ℃加熱條件下蒲公英清膏咖啡酸質量分數變化色譜圖Figure 4 Chromatograms of content of caffeic acid in dandelion extract by heating at 65 ℃

3 討論

前處理水洗工序對蒲公英藥材咖啡酸質量分數的影響程度主要由加水量、水中滯留時間、水洗次數、水洗方式等因素決定。本研究中雖然水洗0、水洗1和水洗2采用平行烘干，但由于水洗0是在非水潤條件下干燥，而水洗1和水洗2是在水潤條件下干燥，干燥過程中水潤時間對咖啡酸的影響程度較水洗0嚴重(水潤條件下，咖啡酸質量分數也呈下降趨勢)，故實際大生產時應嚴格控制蒲公英藥材水洗工序的次數及時間，應采用槍水洗或干洗。

本研究結果顯示，水潤條件下蒲公英藥材咖啡酸質量分數呈持續下降趨勢，而提取濃縮液清膏水浴65 ℃條件下、放置8 h，其咖啡酸質量分數卻沒有明顯變化。這可能是由于咖啡酸結構中含有不飽和雙鍵，水潤條件下容易被氧化，而清膏在具塞錐形瓶中加熱，生產濃縮過程在密閉空間完成，咖啡酸沒有直接與氧氣接觸，難以被氧化，因此質量分數變化較小。

綜上所述，蒲公英藥材前處理生產工序中水洗次數、水潤時間為咖啡酸質量分數下降的主要影響因素，應成為生產過程中質量風險控制的關鍵點。蒲公英配方顆粒生產最佳方式應采用藥材產地趁鮮凈制，生產前干洗挑選的工藝。