不同產地的大棗藥材UPLC指紋圖譜及含量測定方法研究

曾杉，甘偉發，史紫娟

(國藥集團廣東環球制藥有限公司，廣東 佛山 528303)

大棗(ZiziphusjujubaMill.)俗名又稱紅棗，是鼠李科植物棗的成熟果實，臨床上具有補中益氣、養血安神的效果，具有很高的食用和藥用價值。大棗在中藥復方中入藥的歷史十分悠久，在《傷寒論》、《本草綱目》、《千金翼方》等多部古籍中均有入藥記載。現代藥理學研究表明，大棗在抗腫瘤、改善心腦血管系統、增強人體免疫力和造血功能等方面均有明顯藥效[1-2]。大棗化學成分復雜，含有多達上百種成分，主要成分為核苷酸類、生物堿類、皂苷類、黃酮類、糖類化合物等，其中包括環磷腺苷(cAMP)、尿嘧啶、鳥苷、蘆丁、槲皮素、葡萄糖和鼠李糖等多種化學成分[3]。

中藥配方顆粒是飲片采用傳統水煎煮方式提取后通過現代成型工藝制備所得的顆粒制劑，具有服用、貯藏方便且易于攜帶等諸多優點。中藥配方顆粒質量標準的提高需深入開展藥材飲片特征圖譜研究，并建立原料質量控制體系[4]。環磷腺苷(cAMP)是大棗的主要水溶性成分之一，果實中含量最高，在生理生化過程中作為反向調節的第二信使，在基因轉錄和蛋白質合成中發揮重要作用。美國藥典委員會出版的《草藥法典》(Herbal Medicines Compendium)標準集中收載了大棗的相關質量標準，該標準以環磷腺苷為含量測定指標并規定其質量分數不得少于0.010%。目前，對于大棗藥材指紋圖譜和含量研究文獻相對甚少[5-7]，2015年版《中國藥典》制定的大棗藥材標準中僅通過性狀、顯微、薄層鑒別等項目控制大棗藥材的質量，并無含量測定和指紋圖譜項[8]。本研究建立了15批不同產地大棗藥材的指紋圖譜和含量測定的UPLC法，完善和提高了大棗藥材的質量控制標準，為提高大棗配方顆粒的質量控制水平提供了依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

H-class UPLC高效液相色譜儀(PDA二極管陣列檢測器，Water公司)；AL104 型電子天平(Mettler Toledo公司)；KQ-500DE型超聲儀(昆山超聲儀器有限公司)；M Millipore Synergy UV 超純水儀(美國默克公司)。

1.2 試藥

對照品：環磷腺苷(中國食品藥品檢定研究院，批號：140709-201404)，蘆丁(中國食品藥品檢定研究院，批號：100080-201610)，5-羥甲基糠醛(中國食品藥品檢定研究院，批號：111977-201501)，鳥苷(中國食品藥品檢定研究院，批號：111977-201501)；甲醇、乙腈為HPLC級，實驗用其他試劑均為AR級。

1.3 樣品

15批大棗藥材(編號S1-S15)分別從河南、山東、山西、甘肅、河北等不同產地購得，其中編號S1-S3采集地點為山東省臨沂市平邑縣，編號S4-S6采集地點為河南省安陽市內黃縣，編號S7-S9采集地點為甘肅省武威市民勤縣，編號S10-S12采集地點為山西省長治市沁源縣，編號S13-S15采集地點為河北省滄州市滄縣，按2015年版《中國藥典》檢驗均合格。

2 指紋圖譜方法的建立

2.1 色譜方法

色譜柱：Waters HSS T3(150 mm×2.1 mm，1.6 μm)；流動相：0.1%磷酸溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～3 min，0%B；3～12 min，0%→10% B；12～25 min，10%→20%B；25～30 min，20%→95%B)；柱溫：30 ℃；流速：0.25 mL/min；波長：254 nm；進樣量：1 μL；理論塔板數按環磷腺苷峰計應不低于10 000。

2.2 對照品溶液的制備

取環磷腺苷、5-羥甲基糠醛、鳥苷、蘆丁對照品適量，精密稱定，加40%(體積分數，下同)甲醇制成每1 mL分別含環磷腺苷50 μg、5-羥甲基糠醛20 μg、鳥苷50 μg、蘆丁20 μg的對照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取大棗藥材粉末(過三號篩)約2.0 g，精密稱定，置具塞量瓶中，精密加入40%甲醇20 mL，稱定質量，超聲處理(500 W，40 kHz)20 min，取出，放冷，用40%甲醇補足損失質量，5 000 r/min離心5 min，取上清液，濾過，即得。

2.4 共有峰的確認

精密吸取“2.2”項下的對照品溶液和“2.3”項下供試品溶液各1 μL，進樣測定，記錄色譜圖，結果顯示峰6、峰7、峰9和峰14保留時間分別與鳥苷、環磷腺苷、5-羥甲基糠醛和蘆丁對照品保留時間相對應，見圖1。

圖1 對照品及大棗藥材的HPLC色譜圖Figure 1 HPLC of reference substances and Ziziphus jujube

2.5 指紋圖譜方法學考察

2.5.1 精密度試驗 取同一批藥材(編號：S4)按“2.3”項方法制備溶液，連續進樣6次，以環磷腺苷為參照峰，計算各特征峰相對保留時間的RSD值均小于1.0%，相對峰面積RSD值均小于5.0%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 穩定性試驗 取同一份供試品(編號：S4)溶液，按“2.1”項色譜條件分別在0、2、4、8、12、16、24 h進樣測定，以環磷腺苷為參照峰，計算各特征峰相對保留時間的RSD值均小于1.0%，相對峰面積RSD值均小于5.0%，表明供試品溶液24 h內穩定性較好。

2.5.3 重復性試驗 取同一批藥材(編號：S4)，按“2.3”項方法平行制備6份供試品溶液進樣測定，以環磷腺苷為參照峰，計算各特征峰相對保留時間的RSD值均小于1.0%，相對峰面積RSD值均小于5.0%，表明方法重復性良好。

2.5.4 中間精密度試驗 取同一批藥材(編號：S4)，由不同實驗人員在不同日期按“2.3”項方法平行制備6份樣品進樣測定，以環磷腺苷為參照峰，計算各特征峰相對保留時間的RSD值均小于1.0%，相對峰面積RSD值均小于5.0%，表明方法中間精密度良好。

2.6 指紋圖譜的測定

取15批不同產地的大棗藥材按“2.3”項方法制備供試品溶液進行測定，將結果導入相似度軟件進行擬合并生成對照指紋圖譜，選擇峰面積穩定的色譜峰作為共有峰，最終確定14個穩定的共有峰，并通過對照品指認其中的鳥苷、環磷腺苷、5-羥甲基糠醛和蘆丁4個已知峰，相似度計算結果顯示15批大棗藥材樣品的指紋圖譜相似度均高于0.90以上，表明不同產地的大棗藥材成分差異不大，質量穩定，結果見圖2、圖3和表1。

圖2 15批大棗藥材HPLC指紋圖譜疊加圖Figure 2 HPLC fingerprint of 15 batches of Ziziphus jujube

峰6.鳥苷； 峰7.環磷腺苷； 峰9. 5-羥甲基糠醛； 峰14.蘆丁。

表1 15批大棗藥材相似度分析結果Table 1 Results of similarities test of 15 batches of Ziziphus jujube

3 大棗藥材中環磷腺苷質量分數的測定

3.1 對照品溶液的制備

取環磷腺苷對照品適量，精密稱定，加40%甲醇制成每1 mL含環磷腺苷10 μg的溶液，即得。

3.2 供試品溶液的制備

取本品粉末(過三號篩)約1.0 g，精密稱定，置具塞量瓶中，精密加入40%甲醇溶液10 mL，稱定質量，超聲處理(500 W，40 kHz)30 min，放冷后用40%甲醇補足減失質量，搖勻，濾過，即得。

3.3 色譜條件

色譜柱為Waters BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；以甲醇-0.05 mol/L KH2PO4溶液溶液(體積比8∶92)為流動相；檢測波長為259 nm；進樣量為1 μL；流速為0.4 mL/min；柱溫為30 ℃。按上述色譜條件取對照品、空白溶劑和供試品溶液進行，色譜圖見圖4。

圖4 環磷腺苷對照品、空白溶劑及大棗藥材的色譜圖Figure 4 HPLC of cAMP, blank control and Ziziphus jujube

3.4 方法學考察

3.4.1 線性關系考察 精密稱取環磷腺苷對照品10.73 mg，置50 mL量瓶中，加40%甲醇定容，作為儲備液。分別精密量取上述儲備液稀釋成1.073、5.365、10.73、21.46、42.92 μg/mL的對照溶液，精密吸取各濃度對照品溶液1 μL，注入液相色譜儀，按“3.3”項色譜條件進行測定，以峰面積積分值為縱坐標、環磷腺苷的質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，得線性回歸方程Y= 0.7 046X- 0.040 7，r=1.000 0，表明環磷腺苷質量濃度在1.073～42.92 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

3.4.2 精密度試驗 取大棗藥材(編號：S8)按“3.2”項方法制備供試品溶液，連續進樣6 次，計算環磷腺苷峰面積RSD值為0.09%，表明儀器精密度良好。

3.4.3 穩定性試驗 取新制備的供試品溶液(編號：S8)分別在0、2、4、8、12、16、20、24 h進樣測定，計算環磷腺苷色譜峰峰面積RSD值為0.26%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

3.4.4 重復性試驗 取同一批大棗藥材(編號：S8)同法平行制備6份溶液進樣，計算環磷腺苷平均質量分數為221 μg/g，其RSD值為0.49%，表明方法重復性良好。

3.4.5 加樣回收率試驗 精密稱取折干后量分數為221 μg/g的大棗藥材粉末(編號：S8，水分：18.5%)約0.5 g，平行6份，各加入環磷腺苷對照品97.80 μg，按“3.2”項方法制備供試品溶液，進樣測定，分別計算加樣回收率，結果見表2?？梢姡佘占訕悠骄厥章蕿?04.10%，RSD值為3.81%，表明方法準確度良好。

表2 環磷腺苷加樣回收率試驗結果Table 2 Results of recovery of cAMP

3.5 15批大棗藥材中環磷腺苷質量分數的測定 取15批不同產地大棗藥材樣品，按“3.2”項方法制備供試品溶液，按“3.3”項色譜條件測定環磷腺苷的質量分數，結果見表3?？梢姡?5批不同產地的大棗的環磷腺苷質量分數在101～441 μg/g之間，不同產地間的差異不大，以山西省、河南省、甘肅省的較高，山東省和河北省的較低。

表3 15批大棗藥材中環磷腺苷質量分數的測定結果Table 3 Determination results of cAMP in 15 batches of Ziziphus jujube

4 討論

在指紋圖譜方法的建立中，分別進行PDA檢測器全波長掃描比較了不同波長下的差異，考察了乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%磷酸和甲醇-0.1%磷酸不同流動相體系，并比較了25、30、35 ℃柱溫的差異，最終選擇30 ℃柱溫下、乙腈-0.1%磷酸梯度洗脫、波長254 nm的色譜條件。

由于環磷腺苷為水溶性成分，本研究在質量分數測定方法的建立時考察了水、40%甲醇、70%甲醇和稀乙醇4種溶劑對環磷腺苷的提取效果，結果顯示40%甲醇提取效率最高；同時比較了超聲提取和回流提取2種提取方式對提取效率的影響，結果顯示超聲處理30 min的提取效果更好，操作簡單。指紋圖譜指認了鳥苷、環磷腺苷、5-羥甲基糠醛和蘆丁4個成分，由于環磷腺苷質量分數最高，達到萬分之一以上，其余3個成分質量分數均低于萬分之一，誤差較大，因此本研究以環磷腺苷作為質量分數測定指標，其他3個成分不作測定要求。

本研究測定了15批不同產地的大棗藥材UPLC指紋圖譜，共確定了14個特征峰，指認了鳥苷、環磷腺苷、5-羥甲基糠醛和蘆丁4個已知峰，相似度計算結果顯示15批大棗藥材的指紋圖譜相似度均高于0.90以上。同時建立了大棗藥材中環磷腺苷質量分數測定方法，結果顯示15批不同產地的大棗的環磷腺苷質量分數在101～441 μg/g之間，不同產地間的差異不大，以山西省、河南省、甘肅省的較高，山東省和河北省的較低，與文獻[6]中山東大棗藥材含量(168 μg/g)基本相符。

綜上所述，本研究中建立大棗藥材指紋圖譜和質量分數測定的方法簡單易操作，穩定性和重復性均良好，可作為大棗藥材的質量控制方法。